24-表油菜素內酯對葡萄葉片抵御霜霉菌侵染的影響

劉 慶，欒雪濤，徐世彥，孟 瑩，高江曼，惠竹梅

（西北農林科技大學葡萄酒學院/陜西省葡萄與葡萄酒工程中心/陜西省果樹繁育中心，陜西楊凌 712100）

24-表油菜素內酯對葡萄葉片抵御霜霉菌侵染的影響

劉 慶，欒雪濤，徐世彥，孟 瑩，高江曼，惠竹梅

（西北農林科技大學葡萄酒學院/陜西省葡萄與葡萄酒工程中心/陜西省果樹繁育中心，陜西楊凌 712100）

【目的】研究外源 24-表油菜素內酯（24-epibrassinolide，EBR）處理對霜霉菌侵染葡萄葉片的影響，為探究葡萄霜霉病的致病機理提供參考。【方法】試驗以歐亞種釀酒葡萄（Vitis vinifera. L）赤霞珠（Cabernet Sauvignon）葉片為材料，在霜霉菌侵染離體葡萄葉片的初期，研究不同濃度的EBR處理（0.1、0.5和1.0 mg·L-1EBR）對葡萄葉片霜霉病發病率和病情指數、霜霉菌菌絲生長、孢囊梗的形成、氣孔周圍孢子數量、葡萄葉片氣孔開度和內源激素含量的影響及相互關系。【結果】EBR各處理均顯著抑制了接種霜霉菌0.5 h后葡萄葉片氣孔開度，以及接種后1 d和2 d病菌菌絲的發育。0.5和1.0 mg·L-1EBR處理均顯著抑制了接種霜霉菌0.5 h后葉片氣孔周圍的游動孢子數量和3 d后菌絲體在侵染區域的覆蓋面積；接種4 d后，EBR各處理均顯著抑制了霜霉菌孢子囊數量以及葉片發病率與病情指數，且0.5 mg·L-1和1.0 mg·L-1EBR處理降低發病率和病情指數的幅度最大，發病率分別比CK降低51.4%和45.0%，病情指數分別降低71.2%和62.9%。總體而言，0.5 mg·L-1和1.0 mg·L-1EBR處理抑制霜霉菌生長發育較為顯著，且二者之間無顯著性差異。0.5 mg·L-1EBR處理的葉片脫落酸（ABA）、茉莉酸（JA）和水楊酸（SA）含量與CK之間均存在顯著差異，氣孔孔徑與SA含量，ABA含量與JA含量呈顯著正相關。【結論】EBR處理提高了葡萄葉片抵御霜霉菌侵染的能力，可能與其抑制病菌發育，改變寄主內源激素含量，從而促進氣孔關閉等因素有關。

葡萄；霜霉病菌；24-表油菜素內酯；誘導抗病性；氣孔開度

0 引言

【研究意義】葡萄霜霉病［Plasmopara viticola （Berk. & Curt.） Berl. & de Toni］是葡萄生產中最重要的病害之一。在溫暖和濕潤的地區，霜霉病在短時間內迅速蔓延，影響葡萄葉片和果實正常發育，造成巨大的經濟損失［1］。油菜素內酯（Brassinosteroids，BRs），是植物中廣泛存在的甾醇類植物激素。研究發現BRs能夠調節一系列的植物生長與發育［2］，而且越來越多的試驗證明 BRs不僅能夠緩解植物非生物脅迫，例如鹽脅迫［3-4］、寒冷脅迫［5-6］、干旱脅迫［7-8］、重金屬脅迫［9-10］，還能夠提高植物對生物脅迫的抗性［11-13］。NAKASHITA等［11］研究指出BRs能夠激發煙草針對煙草花葉病毒（TMV）、煙草野火病菌（Pseudomonas syringae pv. Tabaci）和粉孢菌（Oidium sp.）的侵染產生防御反應。在冬棗與柑橘的貯藏試驗中，用BRs與EBR分別處理均減輕了采后果實的發病［14-15］。因此，研究24-表油菜素內酯（EBR）提高葡萄葉片對霜霉病的抗性及其作用機理對霜霉病的防治具有重要意義。【前人研究進展】在一個生長季節內，葡萄霜霉菌（P. viticola）的孢子囊和游動孢子可通過氣孔對葡萄進行多次再侵染［16］，而在霜霉菌侵染葡萄葉片的過程中，通過葉片的組織觀察可以直觀高效地觀察到寄主與病原菌之間的相互作用，進而判斷寄主的抗病性或霜霉菌的致病力［17］。通過熒光顯微鏡觀察霜霉菌侵染葡萄葉片（接種后24、30、48和120 h），發現用硫胺素處理能提高葡萄葉片的抗病性［18］。在研究核黃素誘導葡萄對霜霉菌侵染產生防御反應的試驗中，通過接種霜霉菌后24、48和72 h顯微觀察病菌從孢子囊長出初生菌絲到形成網狀菌絲體，明確了核黃素處理提高了葡萄對霜霉病的抗性［19］。氣孔是病菌侵染的潛在天然通道，植物激素在調節氣孔關閉上發揮著重要的作用［20-22］，能通過保衛細胞關閉氣孔，阻止病菌的侵染、蔓延［20］。大量試驗證明脫落酸（ABA）積極地參與調控氣孔關閉過程，以此來抵御病原菌對寄主細胞侵染［14，23］。保衛細胞在感知病菌相關分子信號后，激發水楊酸（SA）通過ABA信號途徑誘導氣孔關閉［20］；另外，研究還發現茉莉酸（JA）依靠Ca2+，NO、ROS信號，并激發K+通道和S型陰離子通道調節氣孔開度［20-21］。【本研究切入點】EBR處理能夠緩解葡萄非生物脅迫，例如寒冷脅迫，鹽脅迫等。而EBR處理緩解能否緩解葡萄生物脅迫，如霜霉病菌侵染等還未見報道。【擬解決的關鍵問題】以歐亞種釀酒葡萄赤霞珠葉片為材料，通過離體葉片接種葡萄霜霉菌，采用熒光顯微鏡和掃描電鏡觀察 EBR處理對霜霉菌侵染葡萄葉片過程中形態結構和葉片氣孔開度的影響；并通過測定激素水平變化與氣孔開度的關系，探明 EBR處理提高葡萄葉片抵御霜霉菌侵染的作用機制，為全面揭示葡萄抗霜霉病的作用機理提供理論依據。

1 材料與方法

試驗于 2015年在西北農林科技大學葡萄酒學院進行。

1.1試驗材料

試驗場所為葡萄冷棚溫室。供試品種為歐亞種（Vitis vinifera L.）釀酒葡萄赤霞珠（Cabernet Sauvignon）。選擇長勢一致、健康狀況良好的植株，帶柄采集副梢幼葉（從上至下第3—6節葉片）。

在陜西楊凌地區葡萄霜霉病發病初期，采集發病的葡萄幼葉，用無菌水沖洗葉片發病區域，收集霜霉菌孢子囊懸浮液并搖勻，利用血球計數板統計霜霉菌孢子囊數量，調配孢子囊懸浮液至試驗濃度（5×105個/mL）。

1.2試驗設計

本試驗采用的24-表油菜素內酯（24- epibrassinolide，EBR）購自美國Sigma公司，Ruibio分裝。試驗共設4個處理，分別是①EBR1：0.1 mg·L-1EBR；②EBR2：0.5 mg·L-1EBR；③EBR3：1.0 mg·L-1EBR；④CK：清水處理。EBR母液配置方法：稱取1.0 mg EBR，用98%（v/v）乙醇將其溶解。將 EBR母液稀釋到適宜濃度，乙醇最終含量為0.1%（v/v），用吐溫-80作為

展開劑，最終含量為 0.1%（v/v）。清水對照中加入同樣體積的98%乙醇和吐溫-80。從溫室中采集的葡萄葉片（帶葉柄）經無菌水清洗2—3遍，自然晾干。將葡萄幼葉的葉柄斜切至一定長度，并將葡萄葉柄浸沒在不同濃度的 EBR溶液中，然后將葉片放置在溫度22℃、濕度95%、光照強度1 000 lx的人工氣候箱中3 h。激素處理結束后，立即用打孔器（d=14 mm）在葉片上打孔，收集葉圓片并置于墊有濕潤濾紙的培養皿中。EBR處理3.5 h后接種葡萄霜霉菌，每個葉圓片接種40 μL葡萄霜霉菌懸浮液，且濃度為5×105個孢子囊/mL。接種完成后，將培養皿放置于白天溫度為22℃、濕度95%、光照強度1 000 lx和夜晚溫度20℃、濕度90%的人工氣候箱中。試驗中每個處理設置3次重復，每個重復包含10個培養皿，每個培養皿中放置10枚葡萄葉圓片。分別在接種霜霉菌后0.5 h、1、2、3和4 d后采樣，用于觀察和測定霜霉菌侵染過程中病菌和葉片相關指標。

1.3測定指標與方法

1.3.1氣孔孔徑（stomatal aperture）的測定 接種霜霉菌0.5 h后，切取邊長為5 mm的正方形葉片，浸沒于2 mL 4%的戊二醛溶液中12 h，固定葉片組織。次日將葡萄葉片用磷酸緩沖液清洗3次，每次10 min。隨后用30%、50%、70%、80%和90%的梯度酒精進行脫色處理，每個濃度處理一次，每次10—15 min，最后用100%的酒精脫色3次，每次30 min。脫色后的葉片用乙酸異戊酯置換30 min。葉片經零界點干燥和噴金處理后，置于場發射掃描電鏡下觀察［24］。

1.3.2氣孔周圍平均游動孢子數量（number of spores per stoma） 接種霜霉菌0.5 h后，將采集到的葡萄葉圓片樣品浸沒在盛有9.2 mmol·L-1三氯乙酸溶液的試管中進行溫和脫色。配置1%（v/v）Blankophor （Maya，China）母液，并用蒸餾水稀釋母液濃度至5%。將葡萄葉圓片放置在載玻片上，并向葡萄葉圓片背面上添加2 mL稀釋后的熒光增白劑溶液，染色2 min后，蓋上蓋玻片。將制備好的樣品放置在熒光顯微鏡下觀察。熒光發射的激發波長為340 nm，在380 nm濾光停止［16］。

1.3.3苯胺藍染色法 將葡萄葉圓片浸沒在盛有 1 mol·L-1KOH溶液的試管中，并將試管放置在121℃的滅菌鍋中10 min，進行高溫脫色。脫色完成后，用無菌水清洗葉圓片，共清洗3次，每次15 min，然后用0.05%苯胺藍染液（以 pH 9—10的 0.067 mol·L-1K2HPO4溶液為溶劑）進行組織結構染色［16］。苯胺藍染色后在熒光顯微鏡下觀察拍照［25］，記錄菌絲長度與霜霉菌第1—4天的形態特征變化。

1.3.4發病率與病情指數的調查 先針對葉圓片進行數碼拍照，然后應用Photopshop CS5統計發病面積［25］；依據霜霉病發病面積占葉圓片面積的百分比劃分8個等級，其中0級：未發病，1級：0.1%—5.0%，2級：5.1%—15.0%，3級：15.1%—30.0%，4級：30.1%—45.0%，5級：45.1%—60.0%，6級：60.1%—85.0%，7級：85.1%—100%。

1.3.5葉片內源激素ABA、SA、JA含量的測定 采用高效液相色譜-質譜聯用儀測定［26］。

1.4數據處理與分析

試驗采用SPSS 18.0、Photoshop CS5和Excel軟件進行數據分析，采用Origin 8.5軟件進行作圖分析。

2 結果

2.1EBR處理對葉片發病率與病情指數的影響

接種霜霉菌第4天，部分葉圓片上的發病癥狀肉眼即可觀察，在病原菌侵染區域開始觀察到孢囊梗。由圖1中葉圓片發病照片可知，CK對應的葉圓片上附著大量孢囊梗，而EBR處理的葉圓片孢囊梗和菌絲體數量顯著低于CK，其中EBR2與EBR3處理對應的病菌發育受到的抑制最明顯。EBR各處理的葡萄葉圓片的發病率與病情指數均顯著低于CK（圖2），其中以EBR2和EBR3處理的抑制效果最顯著，葉片發病率分別比CK降低了51.4%和45.0%。

2.2EBR處理對葉片氣孔孔徑及氣孔周圍游動孢子的影響

EBR處理顯著影響寄主葉片的氣孔張開程度（圖3）。接種霜霉菌0.5 h后，CK的氣孔孔徑顯著高于所有EBR處理；隨著EBR濃度的增加，葉片氣孔孔徑降低，其中，EBR2和EBR3處理使氣孔孔徑分別比CK降低了63.7%和77.8%。接種0.5 h后，EBR2 和EBR3處理的葡萄葉片氣孔周圍孢子數量顯著低于CK，但EBR1與CK之間無顯著差異（圖4）。

2.3EBR處理對霜霉菌侵染葉片過程中形態特征的影響

接種霜霉菌后第1天，氣孔下囊泡已經長出初生菌絲（圖5），EBR處理的霜霉菌菌絲長度均顯著低于CK。其中，EBR2和EBR3處理的菌絲長度分別只有CK的48.0%和55.3%，且均顯著低于EBR1處理，二者間無顯著差異（圖6-A）。

霜霉菌菌絲長出初生菌絲后，菌絲進一步伸長，陸續形成吸器（圖5）。接種病菌后第2天，CK的菌絲長度顯著高于所有EBR處理，EBR1、EBR2和EBR3的菌絲長度分別比CK降低了32.2%、58.0%和55.1%。EBR2和EBR3處理下的菌絲發育受到的抑制作用最為明顯，且二者之間無顯著性差異（圖6-B）。

圖1　EBR處理對抵御葡萄霜霉菌侵染葉片的影響Fig. 1 Effect of EBR treatments on the resistance against P. viticola

圖2　EBR處理對葡萄葉片霜霉病的影響Fig. 2 Effect of EBR treatment on the downy mildew of grapevine leaf

接種霜霉菌后第3天，侵染區域的葉肉細胞周圍出現網狀的菌絲體，尤其是 CK，葉圓片上菌絲體基本已布滿了侵染區域的葉肉細胞（圖5）。相比之下，EBR2與EBR3的菌絲體生長發育受到強烈的抑制。

接種霜霉菌后第4天，葉片病菌侵染區域開始出現孢囊梗，CK處理的葉片上病菌侵染區域出現大量的孢囊梗，EBR1處理的葉圓片上可以觀察到少量的孢囊梗，而EBR2與EBR3處理的侵染區域則未發現孢囊梗（圖5）。

圖3　葡萄葉圓片上氣孔與表皮細胞Fig. 3 Stomata and epidermal cells on the grape leaf discs

2.4EBR處理對葡萄葉片內源激素的影響

接種霜霉菌0.5 h后，霜霉菌孢子向葉片氣孔周圍聚集。在受到外源EBR處理與病菌侵染而引起的寄主自身防御反應的作用下，葡萄葉片的內源激素發生變化，EBR2處理的葉片ABA、JA和SA含量與CK之間均存在顯著差異（表1）。SA與氣孔孔徑相關系數是0.966，隨著SA含量的增加，氣孔孔徑呈下降趨勢。ABA與JA之間的相關系數為0.985，二者呈顯著的正相關（表2）。

圖4　EBR處理對葡萄葉片氣孔孔徑與氣孔周圍平均游動孢子數量的影響Fig. 4 Effect of EBR treatment on stomatal aperture and number of spores per stoma of grapevine leaf

圖5　EBR處理對霜霉菌侵染葡萄葉片過程中形態特征的影響Fig. 5 Effect of EBR treatment on the morphology of P. viticola invading the grapevine leaf

圖6　EBR處理對平均每個感染區的霜霉菌菌絲長度的影響Fig. 6 Effect of EBR treatment on the linear length of P. viticola colonies per infection

表1　EBR處理對葡萄葉片內源激素含量的影響Table 1 Effect of EBR treatment on the content of endogenous hormone in grapevine leaf

表2　氣孔孔徑、ABA、SA和JA含量之間的相關性Table 2 Correlations between stomatal aperture and contents of ABA， JA and SA

3 討論

油菜素內酯作為一種天然的植物激素，既能促進植物生長發育，還能緩解一系列非生物與生物對植物的脅迫［27］。本研究結果表明，24-表油菜素內酯處理抑制了霜霉菌的菌絲伸長、菌絲體蔓延和孢子囊的產生，從而抑制了霜霉菌的初期生長發育。

植物的氣孔既是調節氣體交換與蒸騰作用的重要途徑，也是病原菌侵染植物的潛在天然通道［20］。番茄細菌性斑點病菌（Pseudomonas syringae pv. Tomato DC3000）選擇性地朝氣孔方向移動，并從開放的氣孔處侵入［28］。小麥條銹菌（Puccinia striiformis f.sp. tritici）侵染寄主的方式也是通過氣孔侵入［29］。為了防止病原菌的侵染，保衛細胞在感知到病菌相關分子模型后，通過調節氣孔孔徑防止病原菌的入侵。本試驗中，EBR處理接種霜霉菌后的葡萄葉片氣孔孔徑顯著低于CK，葡萄霜霉菌生長發育受到抑制可能與葉片氣孔孔徑減小而不利于病原菌的侵入有關。

番茄屬（Lycopersicon spp.）中的一些植物在ABA或黑暗環境的誘導下氣孔關閉，降低了野油菜黃單胞菌（Xanthomonas campestris pv. vesicatoria）的發病率與病情指數［30］。KIEFER等［16］的研究也發現，ABA能誘導氣孔關閉，在一定程度上抑制霜霉菌孢子朝氣孔方向的游動。另外，兩種SA缺陷植株（SA羥化酶過量表達的nahG植株和SA感應缺陷突變體sid2）均能破壞病菌相關分子模型（MAMP）或病菌誘導氣孔關閉［27］，說明SA在氣孔運動中發揮著重要作用。ZENG等［31］的研究表明SA調節氣孔關閉需要通過ABA信號途徑發揮作用。JA遲鈍突變體，jasmonate resistance 1 和coronatine insensitive 1均表現出ABA誘導氣孔關閉效應減弱。相反地，ABA遲鈍突變體aba intensitive 2和ABA低敏感突變體ost1、cpk6均表現為JA誘導氣孔關閉的效應減弱［20］。由此可見，JA與ABA相互作用，共同參與了氣孔運動的調節。本試驗結果顯示，EBR2處理的葡萄葉片ABA和JA含量顯著高于CK，其氣孔孔徑的開張程度相比CK也受到顯著抑制，且ABA與JA之間存在顯著正相關。另外，隨著處理的EBR濃度增加，SA含量逐漸下降，氣孔孔徑逐漸降低，且SA與氣孔孔徑之間存在顯著正相關。EBR處理調節氣孔關閉可能與內源激素ABA、SA和JA相互作用，共同調節氣孔運動有關，但對ABA、SA和JA如何相互作用并調節氣孔運動的作用機理還有待進一步研究。

4 結論

0.1、0.5和1.0 mg·L-1濃度的24-表油菜素內酯處理均能抑制葡萄霜霉菌侵染赤霞珠葡萄葉片，緩解葡萄霜霉病發生，其中0.5和1.0 mg·L-124-表油菜素內酯抑制效果較為顯著。其緩解作用可能與 24-表油菜素內酯減小氣孔孔徑，降低氣孔周圍孢子囊數量，促進葉片氣孔關閉有關。24-表油菜素內酯處理后，葉片ABA、JA和SA含量與CK之間均存在顯著差異，且SA與氣孔孔徑呈顯著相關，ABA與JA含量呈顯著相關；推測氣孔的關閉與EBR處理后內源激素ABA、SA和JA的相互作用有關，三者共同誘導了氣孔運動。

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（責任編輯 趙伶俐）

Effect of 24-epibrassinolide Treatment on Grapevine Leaf Against Plasmopara viticola

LIU Qing， LUAN Xue-tao， XU Shi-yan ， MENG Ying， GAO Jiang-man， XI Zhu-mei
（College of Enology， Northwest A&F University/Shaanxi Engineering Research Center for Viti-Viniculture/Shaanxi Provincial Fruit Trees Propagation Center， Yangling 712100， Shaanxi）

【Objective】 The study researched the effect of 24-epibrassinolide （EBR） treatment on the resistance in grapevine leaf against Plasmopara viticola and the mechanism of the induced resistance. 【Method】 Cabernet Sauvignon （Vitis vinifera L.）grapevine leaves were used for experimental materials. At the early development of P. viticola invading grapevine leaf， the effect of different concentration of exogenous EBR （0.1， 0.5 and 1.0 mg·L-1EBR） on the disease incidence and severity of downy mildew of grapevine leaves， linear length of colonies per infection， the development of P. viticola sporangiophores while this pathogen invading the grapevine leaf， the number of spores per stoma， the stomatal aperture and the content of endogenous hormone and the relation between hormone content and stomatal aperture were investigated. 【Result】 EBR-treated leaves had a significantly lower stomatal aperture at 0.5 h after inoculation. Both on 1 d and 2 d， a significantly lower linear length of P. viticola colonies per infection was observed in all EBR treatments. The spread of mycelium almost covered most of the infection area in control while 0.5 and 1.0 mg·L-1EBR treated leaf resulted in a markedly restricted number of spores per stoma and growth of P. viticola after 3 days of inoculation. After 4 days of inoculation， EBR treatment significantly controlled the development of P. viticola sporangiophores，disease incidence and disease severity， and 0.5 mg·L-1and 1.0 mg·L-1EBR treatment resulted in higher resistance. The leaves treatedwith 0.5 mg·L-1and 1.0 mg·L-1had a lower disease incidence and severity of downy mildew， while disease incidence was decreased by 51.4% and 45.0%，and disease severity drop by 71.2% and 62.9%， and there is no significance between the two treatment. There was a significant difference in ABA， JA and SA contents in grape leaves between CK and 0.5 mg·L-1EBR treatment. Stomatal aperture has significantly positive correlation with SA content while ABA content does with JA content. 【Conclusion】 The increased resistance against P. viticola invasion was possibly related with the suppression of pathogen development and the stomata closure which plant hormone crosstalk involved in.

grapevine； Plasmopara viticola； 24-epibrassinolide； induced resistance； stomata aperture

2015-12-01；接受日期：2016-05-25

國家現代農業產業技術體系建設專項（CARS-30-zp-9）、陜西省自然科學基金（2011JM3004）、西北農林科技大學基本科研業務費專項（QN2009059）

聯系方式：劉慶，E-mail：lq0418nwafu@sina.com。通信作者惠竹梅，E-mail：xizhumei@nwsuaf.edu.cn