紅豆越橘提取物對小鼠慢性應激損傷的防護作用

王 蕾，包 諦，王振宇，韓占友，王 佳，馬 麗（.呼倫貝爾市食品藥品檢驗所，內蒙古海拉爾0000；.呼倫貝爾市衛生統計信息中心，內蒙古海拉爾0000；.哈爾濱工業大學化工學院，黑龍江哈爾濱50000）

紅豆越橘提取物對小鼠慢性應激損傷的防護作用

王 蕾1，包 諦2，王振宇3，韓占友1，王 佳1，馬 麗1
（1.呼倫貝爾市食品藥品檢驗所，內蒙古海拉爾021000；2.呼倫貝爾市衛生統計信息中心，內蒙古海拉爾021000；3.哈爾濱工業大學化工學院，黑龍江哈爾濱150000）

研究紅豆越橘提取物對小鼠慢性應激損傷的防護作用。將60只雄性昆明小鼠隨機分成6組：正常對照組、模型組、陽性對照組（氟西汀4.4 mg/kg·d）、實驗組（紅豆越橘低、中、高劑量分別為50、100和200 mg/kg·d）。采用慢性應激模型，從行為學和生理學角度研究紅豆越橘的抗應激作用。結果表明：與對照組相比，模型組小鼠懸尾不動時間明顯延長（p＜0.01）；腦組織超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、5-羥基色氨（5-HT）含量降低（p＜0.05），丙二醛（MDA）含量升高（p＜0.05）；血清去甲基腎上腺素NE和5-HT含量降低（p＜0.05），糖皮質激素（GC）和乙酰膽堿酯酶（AChE）含量升高（分別為p＜0.01，p＜0.05）。與模型組相比，高劑量組小鼠懸尾不動時間明顯縮短（p＜0.05）；低劑量組小鼠腦組織MDA含量降低（p＜0.05），高劑量組小鼠腦組織SOD含量、高、低劑量組腦組織5-HT含量以及低劑量組腦組織GSH-Px含量均升高（p＜0.05）；高劑量組小鼠的血清GC、AChE含量降低（p＜0.01，p＜0.05），中劑量組血清5-HT含量升高（p＜0.05）。因此紅豆越橘可一定程度地保護機體，減少慢性應激對小鼠造成的不良影響。

紅豆越橘，慢性應激，防護作用，小鼠

應激是指機體對外界或內部各種刺激所產生的非特異性應答反應的總和［1］。過度或持久的應激會對機體造成氧化損傷［2］，尤其是慢性應激會產生一系列的神經內分泌反應，以及由此引起的機體各組織器官功能和代謝改變，慢性應激嚴重影響著人類的身心健康，其更被證實是焦慮和抑郁的重要誘因［3］。

在已有報道中，研究人員找到了一些具有神經保護作用的中藥及天然藥物，它們抗應激抑郁的活性天然成分主要有黃酮類、間苯三酚類、皂甙、花色苷類、低聚糖類、萜類、有機酸等類型化合物。前人已開展了紅豆越橘的研究，證明其具有很好的抗氧化功效，作者的前期實驗也證明了這一點。紅豆越橘為杜鵑花科越橘屬常綠小灌木，果實中含有花色苷、黃酮、有機酸、多糖等活性成分及氨基酸、維生素等多種營養成分［4］。紅豆越橘中最主要的酚類物質是花色苷，其具有抗氧化、抗癌、增強記憶力、降低大腦皮層組織DNA損傷等生物活性［5］。紅豆越橘分布于我國東北地區，資源量大，如果能對其研究開發將有廣闊的應用前景。本文將建立比較經典的慢性應激模型，其將會導致神經、內分泌、免疫和行為等方面的變化［6］，研究紅豆越橘對機體的保護作用，開發安全有效的抗應激天然產物，彌補傳統藥物副作用多的缺點。本文采用60%乙醇溶液超聲輔助提取，得到紅豆越橘提取物，考察其對應激模型鼠的行為和體內抗氧化能力、激素等的影響，旨在初步探討紅豆越橘對慢性應激模型鼠的保護作用，為開發安全有效的天然抗應激食品提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅豆越橘提取物 60%乙醇溶液超聲提取，45℃旋轉蒸發濃縮至近干后，真空冷凍成干粉；超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（GSHPx）試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒 江蘇南京建成生物工程研究所；糖皮質激素、5-羥基色胺、去甲腎上腺素、乙酰膽堿酯酶ELISA試劑盒 美國Rapidbio公司。

FD-1真空冷凍干燥機 北京博醫康實驗儀器有限公司；R200D電子分析天平 德國賽多利斯公司；N-1000旋轉蒸發儀 上海愛朗儀器有限公司；H2050R臺式高速冷凍離心機 湖南湘儀實驗儀器開發有限公司；MODEL-550酶標儀 日本BIO-RAD公司；-80℃DW-86L386冰箱 青島海爾特種電器有限公司。

1.2 實驗動物的來源及分組

雄性昆明小鼠60只，由哈爾濱醫科大學動物實驗中心提供，體重約為（25±2）g，4～6周齡。隨機分成6組，每組10只，分別為正常對照組、模型組、陽性對照組和實驗組（低、中、高劑量）。陽性對照組灌胃氟西汀溶液4.4 mg/（kg·d），參考《實驗藥理方法學》確定實驗組灌胃不同劑量的紅豆越橘提取物［低中高給藥劑量分別為50、100和200 mg/（kg·d）］，模型組和正常對照組灌胃同體積的蒸餾水，每日1次，連續18 d。

1.3 小鼠慢性應激模型的建立

除正常對照組外的實驗動物進行18 d隨機慢性刺激，夾尾（1 min）、晝夜顛倒24 h、搖晃（水平搖床，速率60次/min，15 min）、超聲噪音刺激20 min、禁食、禁水，每日采用一種刺激，并且同種刺激不能連續出現，使動物預料不到刺激的發生。正常組不予任何刺激，自由飲食攝水，自然光照。各實驗組和陽性對照組從刺激的第2 d開始給藥。應激處理后第18 d分別對各組進行行為學和生理學指標測定［7］。

1.4 體重及懸尾實驗

于應激的第18 d進行小鼠懸尾不動時間實驗，參照Steru等［8］方法，將小鼠距離尾端約2 cm處的部位用膠帶固定在一個水平板上，使小鼠頭朝下呈倒掛狀態，讓其頭部距離水平地面約5～6 cm，并將相鄰小鼠的視線用木板隔開，記錄每只小鼠在4 min內累計不動時間。懸尾實驗后對小鼠進行稱重。

1.5 樣本的制備及測定方法

1.5.1 血清的制備 應激第18 d進行小鼠懸尾實驗并稱重后，摘除小鼠眼球，收集眼球血液于2 mL采血管中，置于4℃冰箱保存，然后5000 r/min低溫離心10 min，小心吸取上清，置于-80℃冰箱中保存備用。

1.5.2 組織勻漿的制備 取適量的組織于研缽中，加少許液氮，用缽杵進行快速研磨，組織充分研磨后，加入適量預冷的0.9%生理鹽水，將組織勻漿移入離心管中，用剩余的生理鹽水補充至組織重量的10倍。將10%勻漿液在4℃條件下4000 r/min離心10 min，取上清，分裝后置于－80℃保存，備用。

1.5.3 測定方法

1.5.3.1 腦組織各指標的測定 分別參照各試劑盒的說明書，采用黃嘌呤氧化酶法測定SOD活力；用硫代巴比妥酸法測定小鼠腦組織中的MDA含量；根據谷胱甘肽和二硫代二硝基苯甲酸作用，會生產黃色的5-硫代二硝基苯甲酸，測定GSH-Px含量。按試劑盒說明書進行操作。采用雙抗體夾心法測定單胺類遞質5-羥基色胺（5-HT）和去甲腎上腺素（NE）的含量，具體方法及操作參照試劑盒說明書。

1.5.3.2 血清各指標的測定 小鼠血清糖皮質激素（GC）、5-HT、NE、乙酰膽堿酯酶（AChE）含量均采用雙抗體夾心法測定，具體方法參照試劑盒說明書。

1.6 數據處理與統計分析

實驗中測定結果做3次重復，實驗結果以平均值±標準方差（means±SD）表示。結果采用Origin 8.5軟件（OriginLab公司）進行計算繪圖，采用統計分析軟件Sigmaplot 10.0和SPSS statistics V17.0（SPSS公司）進行顯著性分析，以p＜0.05具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 紅豆越橘對小鼠體重的影響

18 d應激結束后，準確稱量小鼠體重。結果見表1，小鼠灌胃前，正常對照組、應激模型組、實驗組和氟西汀組的小鼠體重平均在（26±4.0）g。灌胃18 d后，各組小鼠的體重均增加了約2.0 g，各組小鼠18 d后的體重均與第1 d的體重有顯著差異。空白組小鼠體重增加量高于其他5組，可能與實驗過程中禁食禁水有關。但紅豆越橘組和氟西汀組小鼠體重增加量均比模型組高，說明慢性應激對小鼠體重有一定影響，紅豆越橘對此有改善作用，且紅豆越橘提取物對小鼠無亞急性毒性作用。

表1 紅豆越橘提取物對應激小鼠體重變化的影響Table1 The effect of Lingonberry extraction on weight change in stressed mice

2.2 紅豆越橘提取物對小鼠懸尾不動時間的影響

如表2所示，與空白對照組比，模型組小鼠懸尾不動時間明顯延長（p＜0.01），與模型組相比，氟西汀和紅豆越橘中、高劑量組顯著縮短小鼠不動時間（p＜0.05）。

表2 紅豆越橘提取物對應激小鼠懸尾不動時間的影響Table2 The effect of Lingonberry extraction on the immobility time in tail suspension mice

懸尾實驗是通過給動物施加不能逃避的應激刺激，以造成動物行為絕望，用此來模擬人類抑郁癥的癥狀，是國內外最常用于抗抑郁藥物篩選的動物模型［9］。同時，本實驗結果顯示慢性應激作用可以使小鼠產生抑郁癥狀，表現為懸尾不動時間明顯延長，而紅豆越橘三個劑量組均能在不同程度上拮抗模型動物在懸尾實驗中不動時間的延長，這從動物行為學實驗的角度證明，紅豆越橘提取物對小鼠抑郁樣行為具有一定改善作用。

2.3 紅豆越橘提取物對應激小鼠腦組織SOD活力的影響

總SOD活力結果如圖1所示，與空白對照組相比，模型組的SOD活力顯著降低（p＜0.05）。高劑量組的總SOD與模型組相比顯著增加（p＜0.05）。

圖1 腦組織中的SOD活力Fig.1 SOD activity in brain tissue

2.4 紅豆越橘提取物對應激小鼠腦組織MDA含量的影響

圖2是測得的腦組織MDA含量。由結果可以看出，空白組的MDA含量較低，模型組與空白對照組比含量有顯著提高（p＜0.05），說明慢性應激對小鼠腦部產生了氧化損傷。各加藥組和模型組相比，MDA含量均有降低，且低劑量組降低顯著（p＜0.05）。

圖2 腦組織中MDA含量Fig.2 MDA levels in brain tissue

2.5 紅豆越橘提取物對應激小鼠腦組織GSH-Px的影響

結果如圖3所示，模型組的GSH-Px活力與空白組相比，顯著降低（p＜0.05），紅豆越橘干預組對小鼠腦組織中的GSH-Px活性均有提高，紅豆越橘低劑量組提高腦組織GSH-Px的作用最顯著（p＜0.05）。

圖3 腦組織中GSH-Px活力Fig.3 GSH-Px activity in brain tissue

本研究在抗氧化方面，選用SOD、MDA和GSH-Px指標。在慢性應激條件下，體內會生成過量的氧自由基，而腦組織中自由基的增多，發生脂質過氧化，是導致神經退行性疾病的一個重要原因，也是導致人認知能力障礙的一個原因［10］。GSH-Px和SOD是機體內廣泛存在的兩種過氧化物分解酶，能夠保護細胞膜的結構和功能不受過氧化物的干擾及損害。脂質過氧化產物MDA廣泛作為自由基損傷標志之一，在臨床上也常觀察到抑郁癥患者體內MDA含量過高，而經過一些抗抑郁藥物治療后可顯著減低其MDA含量［11］。本實驗中應激對小鼠腦內抗氧化酶系產生了一定影響，降低了腦組織內SOD和GSH-Px活力，升高了MDA含量，而紅豆越橘可以不同程度地抑制這種影響的發生，證明其有保護腦組織內抗氧化酶活性和抑制脂質過氧化物產生的作用，從而保護細胞膜免受自由基損害，通過此途徑保護神經元，有效地抑制自由基對腦組織的損傷。

2.6 紅豆越橘提取物對應激小鼠GC含量的影響

測得應激小鼠血清GC含量的結果如圖4所示。模型組小鼠的GC水平與空白對照組相比極顯著升高（p＜0.01）。與應激模型組相比，紅豆越橘提取物的干預可逆轉糖皮質激素水平的升高，紅豆越橘高劑量組作用極顯著（p＜0.01）。

圖4 小鼠血清GC含量Fig.4 GC levels in mice serum

激素水平是應激的重要指標，當機體長期處于應激狀態時，HPA軸功能亢進，會分泌大量的GC，以適應應激的需要。而HPA軸功能的持續亢進，將嚴重影響身心健康，從而使機體出現抑郁癥狀［12］。GC水平升高還可導致與認知和記憶關系密切的海馬細胞的死亡，進而導致認知功能降低。抗糖皮質激素治療對重癥抑郁癥患者效果明顯［13］。本實驗中，應激組小鼠血清GC較空白對照組顯著升高，說明慢性應激導致了HPA軸功能紊亂；而抗抑郁藥氟西汀組和紅豆越橘中、高劑量組均能顯著降低GC濃度，證明其在調節GC水平上具有一定的改善作用，從而保護神經，達到抵抗情緒應激的作用。

2.7 紅豆越橘提取物對應激小鼠NE的影響

圖5為小鼠血清和腦組織中NE含量測定結果。與空白對照組相比，模型組小鼠血清和腦組織NE含量均有不同程度降低，且血清中含量降低比腦組織中降低更為顯著。模型組小鼠血清NE含量與空白組相比降低顯著（p＜0.05），說明應激造成小鼠血清中神經遞質NE含量變化，而模型組的腦組織NE含量降低與空白對照組無顯著差異。氟西汀組血清NE含量與模型組相比升高極顯著（p＜0.01），與空白組無顯著差異（p＞0.05）。但是氟西汀對腦組織中的NE無顯著影響。

圖5 小鼠血清及腦組織中的NE含量Fig.5 NE levels in mice serum and brain tissue

2.8 紅豆越橘提取物對應激小鼠5-HT的影響

測定結果如圖6所示。結果顯示，與空白對照組相比，模型組小鼠血清和腦組織中的5-HT含量顯著降低（p＜0.05）。與應激模型組相比，紅豆越橘中劑量組血清中5-HT含量顯著提高（p＜0.05）。紅豆越橘低、高劑量組顯著升高了腦組織的5-HT含量（p＜0.05）。氟西汀增加腦組織中5-HT含量與模型組有極顯著性差異（p＜0.01），這可能跟氟西汀是5-HT再攝取抑制劑有關。

圖6 小鼠血清及腦組織中5-HT含量Fig.6 5-HT levels in mice serum and brain tissue

在抑郁癥等神經性疾病的發病機制研究中，單胺類遞質如NE、5-HT和多巴胺等功能不足，早已得到公認［14］。除一些神經營養因子和激素可以調節神經元生成外，神經遞質5-HT也能刺激海馬齒狀回粒細胞的生成［15］，而抑制5-HT合成以及損傷5-HT系統都會減少神經元的生成。可以通過增加5-HT類神經遞質含量，增強神經元的生成，達到抗抑郁的作用。本實驗的結果表明，慢性應激能夠顯著降低血清及腦組織中的5-HT含量，而氟西汀和紅豆越橘均能夠在不同程度上升高其含量，說明紅豆越橘有通過升高5-HT含量而抗慢性應激損傷和抗抑郁的作用。

2.9 紅豆越橘提取物對應激小鼠乙酰膽堿酯酶（AChE）的影響

如圖7所示，與空白組相比，應激模型組的血清AChE含量有顯著提高（p＜0.05）。不同劑量的紅豆越橘提取物對AChE也有不同程度的抑制作用。高劑量組的作用最顯著，與模型組差異有顯著性（p＜0.05）。低、中劑量組對其也有一定程度的抑制作用，但與模型組差異不顯著。

圖7 小鼠血清AChE含量Fig.7 AChE levels in mice serum

大量實驗證明，應激是一種生物因素，能夠通過改變大腦內的細胞特征，來干擾記憶和學習等認知功能，AChE是一種與認知功能關系密切的酶。有研究發現，在應激性反應過程中，大鼠腦中AChE活性明顯高于正常大鼠，故認為長時間的應激可使動物膽堿能系統機能激活［16］。張曉杰等的研究結果發現，與正常對照組相比，抑郁癥模型大鼠的AChE表達與活性明顯升高［17］，這與本實驗結果相符。紅豆越橘能夠降低應激小鼠腦內AChE含量，這將使乙酰膽堿水平增加，有助于提高模型動物的認知能力。

3 結論

慢性不可預見性應激模型的實驗動物會經歷多種慢性低強度刺激，能較真實地模擬抑郁病人的某些病因和癥狀。本研究結果得到模型組小鼠在行為和生理指標上都表現出抑郁特征，表明慢性應激是有效的抑郁癥動物模型。

實驗結果表明，紅豆越橘提取物提高了小鼠的抗氧化能力，并對機體內相關激素的水平有調節作用，在生理指標上表現出對慢性應激小鼠的保護作用。另外，紅豆越橘提取物增強了懸尾實驗中小鼠的掙扎活動能力，小鼠掙扎活動能力的增強說明紅豆越橘在一定程度上緩解了慢性應激小鼠的“行為絕望”。因此從行為和生理指標兩方面得出紅豆越橘對慢性應激小鼠受到的損傷有一定防護作用。

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Protective effect of Lingonberry extraction on chronic stressed mice

WANG Lei1，BAO Di2，WANG Zhen-yu3，HAN Zhan-you1，WANG Jia1，MA Li1
（1.Hulun Buir Institute for Food and Drug Control，Hailar 021000，China；2.Hulun Buir Center for Health Statistics，Hailar 021000，China；3.School of Chemical Engineering，Harbin Institute of Technology，Harbin 150000，China）

In order to study the protective effect of Lingonberry extraction on chronic stressed mice，total 60 male Kunming mice were randomly divided into 6 groups：normal control group，stressed model group，positive group（Fluoxetine 4.4 mg/kg·d），experience group（low，medium，high dose were 50，100，200 mg/kg·d respectively）.Use the chronic stress animal model to research anti stress effect of Lingonberry in behavior and physiology.Compared with control group，model mice immobility duration significantly prolonged in tail suspended test（p＜0.05），cerebral SOD，GSH-Px and 5-HT decreased（p＜0.05），MDA increased（p＜0.05），serum NE and 5-HT decreased（p＜0.05），GC and AChE increased（p＜0.01，p＜0.05 respectively）.Compared with model group，the mice of high dose group immobility duration significantly shortened in tail suspended test，low dose group mice cerebral MDA reduced（p＜0.05），high dose mice cerebral SOD，high and low dose group mice cerebral 5-HT，and low dose group cerebral tissue GSH-Px content increased（p＜0.05）.High dose group serum GC and AChE decreased（p＜0.01，p＜0.05），middle dose group serum 5-HT increased（p＜0.05）.In conclusion，Lingonberry can greatly protect the body，reduce the adverse effects of chronic stress on mice.

Lingonberry；chronic stress；protective effect；mice

TS201.1

A

1002-0306（2016）06-0346-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.06.061

2015－07－27

王蕾（1989-），女，碩士研究生，食品工程師，研究方向：天然活性物質的分離與研究，食品檢驗，E-mail：wlei198907@163.com。