美拉德反應制備蛋白質-多糖共價復合物的研究進展

何曉葉，邰克東，高彥祥，袁 芳（中國農業大學食品科學與營養工程學院，功能配料與食品添加劑研發中心，教育部功能乳品重點實驗室，北京100083）

美拉德反應制備蛋白質-多糖共價復合物的研究進展

何曉葉，邰克東，高彥祥，袁 芳*
（中國農業大學食品科學與營養工程學院，功能配料與食品添加劑研發中心，教育部功能乳品重點實驗室，北京100083）

蛋白質和碳水化合物通過美拉德反應形成糖基化產物，也稱為共價復合物，可以改善蛋白質的功能特性。本文主要介紹了近年來通過美拉德反應制備蛋白質-多糖共價復合物的方法，共價復合物生成的主要影響因素，共價復合物結構與功能性質的分析方法及其應用。

美拉德反應，蛋白質，多糖，共價復合物，功能性質

蛋白質和多糖是食品原料中兩類重要的生物大分子，是影響食品質構的主要因素。蛋白質具有乳化且穩定食品體系的能力，多糖主要有增稠和持水能力，而蛋白質-多糖共價復合物比其前體物質具有更加優越的性能（乳化性、凝膠性、起泡性、熱穩定性等），在食品、藥品、化妝品等領域具有廣闊的應用前景。目前，蛋白質-多糖共價復合物主要通過美拉德反應制備。而本文主要介紹近年來通過美拉德反應研究蛋白質-多糖共價復合物的最新進展，包括制備方法、共價復合物的影響因素與結構和功能性質的關系，以及共價復合物的應用現狀。蛋白質-多糖共價復合物的美拉德反應動力學研究進展可參閱邵瀾媛等的論文［1］。

1 美拉德反應研究現狀

蛋白質-多糖共價復合物的形成是基于蛋白質分子中氨基酸側鏈的自由氨基（主要是賴氨酸側鏈上的ε-氨基）和多糖分子還原末端羥基之間的羥氨反應，也就是美拉德反應。美拉德反應制備的蛋白質-多糖共價復合物可以增強蛋白質的功能特性，包括溶解性、凝膠型、乳化性、起泡性、熱穩定性、抗氧化性等，還可以構建傳遞系統運送活性物質。表1列舉了2010～2015年間美拉德反應制備蛋白質-多糖共價復合物的代表性研究成果。使用的蛋白主要包括動物蛋白中的乳蛋白（包括酪蛋白、乳清分離蛋白、β-乳球蛋白、α-乳白蛋白）、牛血清白蛋白以及植物蛋白中的大豆蛋白、大米蛋白、小麥蛋白等，使用的多糖為葡聚糖、阿拉伯膠、卡拉膠、麥芽糊精以及一些單糖和二糖等。

2 蛋白質-多糖共價復合物的制備及其主要影響因素

影響蛋白質與多糖發生美拉德反應的主要因素有pH、反應溫度和時間、蛋白質與多糖的比例、相對濕度等［16-18］。美拉德反應速率隨溫度升高而增大，當反應體系的水分活度在0.3～0.7時反應可達到最大速率［19］。隨著pH的增大美拉德反應速率也會增大，在pH為弱堿性時速率最大［19］。多糖的種類、結構、分子量、鏈長也會影響美拉德反應的速率。Niu等［6］研究發現碳水化合物的分子量大小對于共價復合物的功能性質很重要，木糖與蛋白的接枝程度最高，而麥胚蛋白-葡聚糖共價復合物的溶解性和乳化穩定性要顯著高于其他幾種復合物；Seo等［11］研究發現半乳糖比低聚半乳糖和半乳聚糖更易與溶菌酶發生美拉德反應；Geng等［12］研究發現多糖的分子量與形成的共價復合物的熱穩定性呈正相關性。

表1 美拉德反應制備蛋白質-多糖共價復合物及其結構表征和功能特性研究Table1 Structural characteristisc and functional properties of protein-polysaccharide coijugates via the Maillard reaction

目前，通過美拉德反應制備蛋白質-多糖共價復合物的方法主要有干熱法和濕熱法兩種。干熱法是制備蛋白質-多糖共價復合物最傳統的一種方法，它的一般程序是：將蛋白質與多糖分別溶解在水或緩沖溶液中，二者混合均勻后冷凍干燥，將粉末置于密閉容器中，一定溫度和濕度條件下反應一定時間形成共價復合物［20］。一般地，降低溫度就可以抑制這種反應的進行。Miralles等［21］在40℃，相對濕度79%下，研究了2周內β-乳球蛋白與殼聚糖（W/W=1∶4）共價復合物的特性，并通過分光光度法和十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）法分析確定了美拉德反應的發生和產物形成。結果發現，在pH4下，反應2 d所得的復合物乳化性最高，同時美拉德反應產物抑制大腸桿菌的活性也最高。干熱法反應條件容易實現，但反應時間相對較長。因此最近有學者研究了高溫（90，115和140℃）、短時（2 h）干熱條件下通過美拉德反應制備大豆分離蛋白（SPI）-麥芽糊精（MD）的共價復合物［22］。通過蛋白質中自由氨基含量測定和SDS-PAGE法確定了美拉德產物的生成，并且得出140℃條件下制備的SPI-MD復合物的乳化穩定性和貯存穩定性均比90℃和115℃要高，這可能是因為140℃時糖基化程度更高，二者的共價結合的比例更大，相同反應產物的溶液中，更多含量的SPIMD共價復合物提供了足夠的空間位阻，增強了乳液的穩定性。但是干熱法不適用于大規模生產，因為在反應前需要將物料進行干燥，并且在反應時需要控制濕度和溫度，在實際應用中具有局限性。

濕熱法一般是將一定比例的蛋白質與多糖混合水溶液放入密閉裝置中，通過水浴或者油浴進行加熱，最后通過冰浴來降低反應溫度，從而結束反應。此條件下的共價復合反應速度與溫度有關，溫度低時（≤90℃）反應速度較慢，溫度高時（≥100℃）則較快。此法目前主要應用于蛋白質與單糖或二糖之間的反應［10，23］，該法的優點是易于控制并且反應時間較短，但回收產品時需要將水或者緩沖溶液除去［10，23］。

除上述兩種方法外，微波、高靜水壓、超聲波、超臨界CO2等［24-29］新興技術也被逐漸應用到蛋白質-多糖復合反應中。如Xu等［25］的研究表明超高壓條件下形成的β-伴大豆球蛋白-葡聚糖共價復合物的乳化性顯著高于單一蛋白；Dragana等［27］研究表明高強度超聲可以有效地促進美拉德反應（濕熱法）下未變性β-乳球蛋白的糖基化。而超臨界CO2技術在美拉德反應中的應用并不十分理想。Casal等［28］研究發現超臨界CO2處理（30 MPa，50℃）下乳糖-酪蛋白縮氨酸及乳糖-β-乳球蛋白的美拉德反應幾乎難以進行；且超臨界CO2的應用使得不同底物濃度下核糖-半胱氨酸的美拉德反應復雜程度加大，并降低了大多數揮發性物質的生成［29］。這可能是因為在高壓及CO2存在的情況下，樣品發生了酸化，使溶液的pH降低，從而不利于美拉德反應的繼續進行［30］。

3 蛋白質-多糖共價復合物的結構分析

分析蛋白質-多糖共價復合物結構特性的方法主要有電泳法、分光光度法、色譜法、光譜法、質譜法、光散射法等（見表1）。其中，應用最廣泛的當屬電泳法［31-32］。Xu等［33］采用SDS-PAGE技術分析大豆蛋白和葡聚糖（重量比1∶3，1∶6，1∶9）的共價復合物。在用SDS-PAGE之前，復合物和蛋白質樣品用含有SDS和β-巰基乙醇的緩沖液進行處理，破壞交聯和二硫鍵橋聯，以及復合物和蛋白質的疏水性聚合。比單一大豆蛋白更高分子量新條帶的出現，表明大豆蛋白-葡聚糖共價復合物的形成。共軛結合程度可用條帶定量分析來計算。結果表明，使用1∶3，1∶6和1∶9質量比，分別可使大約9%、32%和34%的蛋白質和葡聚糖進行共價結合。

美拉德反應產生的棕色物質可通過分光光度法測定褐變程度（通常是420 nm處測定，見表1）。吸光度值的增加可以作為一個指標來衡量美拉德反應高級階段引起的褐變程度。美拉德反應的程度是由與多糖作用的賴氨酸的平均數量決定。研究美拉德反應程度和蛋白質改性程度的方法包括，鄰苯二甲醛法（OPA）、三硝基苯磺酸法（TNBS）、糠氨酸分析法（ε-N-furoylmethyl-L-lysine）等［34-35］。

此外，一些其他的技術方法也廣泛用于復合物的結構表征，包括動態光散射（DLS）、基質輔助激光解吸電離-飛行時間-質譜（MALDI-TOF MS）、紅外光譜、熒光光譜和圓二色譜（CD）等（見表1）。

4 蛋白質-多糖共價復合物的功能性質

蛋白質-多糖共價復合物的功能性質主要指復合物中蛋白質的功能性質，主要包括乳化性、凝膠性、起泡性，以及溶解性和熱穩定性，最終決定產品的質量。

4.1 乳化性

在蛋白質-多糖共價復合物的功能或工藝特性的研究報道中，共價復合物的乳化性研究最多。乳化性在食品體系中具有重要作用，而蛋白質和多糖對于乳狀液的穩定性又起到關鍵作用。蛋白質在乳化過程中吸附在水-油界面形成一層粘彈性的膜，而多糖通過增稠和凝膠行為提供體系穩定性。有很多研究表明蛋白質-多糖共價復合物顯示出了良好的乳化特性［36-39］。影響復合物乳化性的因素包括多糖的分子量、多糖的含量、多糖的結構、反應時間以及賴氨酸的含量［17］。Zhang等［38］研究了大豆蛋白水解物（HSPI）-麥芽糊精（MD）共價復合物的乳化性，結果表明，80℃反應270 min之后，HSPI-MD共價復合物的乳化活性指數增加到了109.07 m2/g，而單一大豆分離蛋白的乳化活性指數僅為86.13 m2/g。還有研究［39］發現超聲波法結合濕法美拉德反應制備β-伴大豆球蛋白（7S）-MD共價復合物（7S-MDUH），可使共價復合物的表面疏水性，乳化性和乳化穩定性顯著增高。此外，7S-MDUH制備的乳液在極端pH、離子強度和熱處理溫度下亦可保持穩定，這主要是因為蛋白質的表面疏水性和二級結構發生了變化，導致蛋白質分子空間位阻減小，柔韌性增加。

4.2 凝膠性

凝膠具有一種三維網狀結構，可以容納其他的成分和物質，對食品的質地等方面具有重要的作用。通過美拉德反應制備糖基化蛋白可以改善其凝膠特性［40-41］。Matsudomi等［40］研究了干熱法（3 d，60℃，65% RH，卵清蛋白∶半乳甘露聚糖=1∶4）制備卵清蛋白-半乳甘露聚糖共價復合物。結果表明，在90℃下加熱共價復合物溶液（蛋白濃度10%w/v）30 min可改善其凝膠特性。共價復合物所制備凝膠的凝膠強度和持水量都比單一蛋白高。隨著加熱時間的延長，共價復合物凝膠變得透明，而單一蛋白形成的凝膠變得渾濁。Spotti等［41］用干法（2、5、9 d，60℃，63%RH）制備了乳清分離蛋白（WPI）-葡聚糖（DX）共價復合物。研究表明，反應時間顯著影響凝膠特性。WPI/DX混合物凝膠在單軸壓縮下斷裂，而共價復合物在測試條件下未斷裂，在單軸壓縮實驗下承受了80%的變形。另外，對共價復合物凝膠進行了模量和應力松弛測定，并與混合物凝膠進行了對比，結果表明共價復合物凝膠的硬度和緊度更小一些。

4.3 起泡性

食品泡沫通常是指氣體在連續液相或半固相中分散所形成的分散體系。起泡性，一種重要的食品屬性，決定許多食品的質量，例如牛奶、肉、蛋黃醬、冰激凌、冰凍甜點、蛋糕、面包、餡料等。研究發現，美拉德反應制備的蛋白-多糖共價復合物比單一蛋白的起泡性要有明顯提高［8，42］。Medrano等［42］研究發現通過美拉德反應（50℃，65%RH）制備的β-乳球蛋白-乳糖/葡萄糖復合物的起泡性有所提高，且乳糖復合物的泡沫要比葡萄糖復合物的泡沫更穩定。這可能是因為在β-乳球蛋白中加入乳糖，增加了改性蛋白在氣-水界面的吸附，改善了它的起泡性，導致泡沫對于重力排水有了更強的穩定性。產生這些變化都是因為β-乳球蛋白和乳糖形成共價鍵導致其結構上的變化，這種結合使蛋白質分子展開，增加了蛋白質疏水殘基的暴露。Corzo-Martinez等［8］研究了β-乳球蛋白-半乳糖共價復合物的起泡性。在pH7下，與對照組（蛋白經過熱處理但并未加半乳糖）相比，糖基化沒有顯著改變界面特性和起泡性，但在pH5下，共價復合物表現出較好的氣-水界面的動力吸附，與對照組相比有了較好的起泡性。作者認為，美拉德反應制備的β-乳球蛋白-半乳糖共價復合物可替代單一蛋白作為起泡劑使用，且β-乳球蛋白可以在酸性食品中用作起泡劑，如富含蛋白質的碳酸飲料中。

4.4 溶解性和熱穩定性

溶解性直接影響食品的其他功能性質，例如乳化性、起泡性、凝膠性和粘性。因此溶解性是開發新型乳化劑和食品非常關鍵的功能性質。研究發現，糖基化蛋白質的溶解性會有所提高。Kasran等［37］制備了大豆乳清分離蛋白（SWPI）和水解及非水解的香豆膠共價復合物。在22℃，pH3～8范圍內，SWPI-香豆膠共價復合物的蛋白溶解性比SWPI和SWPI-香豆膠混合物有明顯提高，尤其在蛋白質等電點處。但也有一些學者報道美拉德反應會導致蛋白質溶解性的降低［35，43］。這個矛盾現象的發生有可能是因為蛋白質生物化學的復雜性和反應多糖的不同造成的。溶解度的增加是由于糖基化程度的限制，親水的糖殘基對蛋白質的限制攻擊會減少蛋白質自組裝的趨勢。然而二硫鍵橋聯的出現和多肽之間的交聯，可能會是導致蛋白質減少的原因［17］。

熱穩定性分析在食品工業上被廣泛用來檢驗蛋白質抵抗熱處理的能力。熱處理會破壞蛋白質，造成蛋白質分子展開而有聚沉現象發生，并導致蛋白質營養價值的流失。研究表明，糖基化蛋白質的熱穩定性比單一蛋白要有所提高［35，44］。álvarez等［35］研究發現，豬血分離蛋白-葡聚糖共價復合物能夠更好地抵抗熱處理帶來的聚結和沉淀。葡聚糖阻止了蛋白質的聚集，避免了蛋白質之間的相互作用，最終保護了蛋白質原本的結構。

5 蛋白質-多糖共價復合物的應用研究

美拉德反應制備的蛋白-多糖共價復合物與許多化學方法和酶法制備的產物相比具有很好的安全性，而且具備良好的抗氧化性、抑菌性、乳化性、凝膠性等特性，因此可以作為天然新型功能性的抗氧化劑、抑菌劑、乳化劑等，應用于食品、藥品和化妝品中。

5.1 食品

目前，在食品領域，美拉德反應產物主要應用于可食性膜的制備、開發脂肪替代物、一些功能因子的包埋與傳遞、調味料、煙草工業等方面［45-50］。如Wang等［45］利用ε-聚賴氨酸和殼聚糖的美拉德反應產物制備出了結構緊密的可食性膜，在一定條件下具有較好的抗張強度和伸長率，且抗菌性能比單一前體都有所改善。Yang等［46］研究表明SPI-大豆可溶性多糖共價復合物制備的乳液可作為疏水化合物如檸檬醛等物質的腸道運輸載體。張陸霞等［47］以鱈魚排為原料，添加木糖、葡萄糖，在110℃下加熱90 min，制得的美拉德反應產物具有醇厚的海鮮風味，可用于魚味調味料。殼聚糖-雞蛋清溶菌酶復合物可被開發成具有優良乳化性和抑菌性的新型功能性添加劑［48］。

5.2 藥品

蛋白質和多糖等天然高分子來源廣泛，具有良好的生物降解性和生物相容性，和很多藥物分子存在較強的相互作用，因此，近些年來蛋白、多糖及其復合物在藥物制劑領域己有廣泛的應用。研究表明，蛋白-多糖共價復合物具有疫苗作用和抗腫瘤作用，而且還是藥物在生物體中的適宜載體，可用于藥物的緩釋［51］。鄧偉等［52］通過動物實驗研究表明，阿霉素-白蛋白-葡聚糖納米粒子能夠有效抑制腫瘤的增長以及延長小鼠的存活壽命，因此該納米粒子具有潛在的臨床應用前景。并且白蛋白-葡聚糖納米凝膠還可作為布洛芬的載體，可使布洛芬的負載效率提高，整個載藥納米粒子的制備過程綠色，安全，操作便捷［53］。

5.3 化妝品及其他材料

一些天然多糖如殼聚糖等具有良好的抗菌特性以及對人體的親和性，可與蛋白質形成復合物制備出優質的化妝品。目前，已有一些蛋白-多糖復合物應用于護膚品中［54］。另外，隨著高分子材料技術的發展，蛋白-多糖共價復合物也可作為良好的紡織材料、生物材料和防污染材料用于織物、藥物緩釋體系、廢水等污染物的處理方面，且是對人體無毒害作用的性能良好的生物高分子載體［55］。

6 展望

通過美拉德反應對蛋白質進行糖基化，可以改善蛋白質的功能特性。蛋白質-多糖共價復合物對于控制生物活性物質在食品基質中的釋放有很大潛力。但仍需大量研究進行完善和充實。這些研究包括：開發和改進制備和評價共價復合物的方法，使共價復合物的工業化成為可能；為共價復合物結構和功能性質之間的關系提供更多的案例支撐，為共價復合物的廣泛性應用提供理論基礎。

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Progress in protein-polysaccharide conjugates via the Maillard reaction

HE Xiao-ye，TAI Ke-dong，GAO Yan-xiang，YUAN Fang*
（College of Food Science&Nutritional Engineering，Research Center of Functional Ingredients and Food Additives，Key Laboratory of Functional Dairy，China Agricultural University，Beijing 100083，China）

The products formed by glycation of proteins with carbohydrates via the Maillard reaction，also known as conjugates，are agents capable of changing and improving functional characteristics of proteins.This paper mainly reviewed the preparation methods for protein-polysaccharide conjugates via the Maillard reaction，the main influencing factors，the analysis methods of its structures and functional properties as well as its applications over the past several years.

Maillard reaction；proteins；polysaccharides；conjugates；functional properties

TS201.2

A

1002-0306（2016）06-0377-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.06.067

2015－05－22

何曉葉（1988-），女，博士研究生，研究方向：天然產物與功能食品，E-mail：hxy880901@163.com。

袁芳（1967-），女，博士，副教授，研究方向：天然產物與功能食品，E-mail：yuanfang0220@cau.edu.cn。

國家自然科學基金（31371836）。