超高效液相色譜串聯質譜法測定啤酒中伏馬毒素的含量

周貽兵，吳　坤，李　磊，林　野，劉利亞（.貴州省疾病預防控制中心，貴州 貴陽 550004；.貴州師范學院 化學與生命科學學院，貴州 貴陽 55008）

超高效液相色譜串聯質譜法測定啤酒中伏馬毒素的含量

周貽兵1，吳坤2，李磊1，林野1，劉利亞1*
（1.貴州省疾病預防控制中心，貴州 貴陽 550004；2.貴州師范學院 化學與生命科學學院，貴州 貴陽 550018）

該文建立了免疫親和柱凈化-超高效液相色譜串聯質譜法測定啤酒中FB1、FB2和FB3的含量。與液相色譜相比較，無需衍生化，避免了化學衍生法受衍生產物的不穩定性、衍生劑的濃度、溫度和反應時間等衍生效率的影響。采用多反應監測（MRM）方式進行檢測，3種物質在2.5～100 ng/m L范圍具有良好的線性關系，相關系數（R2）均大于0.999，在空白樣品中加入1.0μg/kg和8.0μg/kg兩個濃度水平的伏馬毒素，平均回收率為88.3%～95.1%，相對標準偏差（RSD）在4.5%～8.1%，3種物質定量限均低于0.6μg/kg，精密度試驗結果相對標準偏差（RSD）為0.9%～1.7%。該方法準確度高、精密度好，適用于啤酒中伏馬毒素含量的測定，可為啤酒中伏馬毒素的風險評估數據來源提供參考依據。

超高效液相色譜串聯質譜法；伏馬毒素；檢測；啤酒

伏馬毒素（fumonisins，FBs）是一類由串珠鐮刀菌（Fusarium moniliforme）、多育鐮刀菌（Fusarium proliferatum）、輪狀鐮刀菌（Fusarium verticillioides）和尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）等產生的真菌毒素［1-2］。目前發現伏馬毒素類似物有28種，分為A、B、C和P四組，以B族的FB1、FB2和FB3為主要存在形式［3］。伏馬毒素是污染食品的主要成分之一，特別是FB1廣泛存在于玉米及其制品中，約占伏馬毒素總量的70%，伏馬毒素通過污染大米、小麥、大麥、調味品、高粱、啤酒、牛奶等多種食品和飼料，對人的健康和畜牧業發展構成潛在威脅［4-7］。毒理學及流行病學調查表明，伏馬毒素與馬腦白質軟化癥（equine leukoencephalomalacia，ELEM），豬肺水腫癥（pig pulmonary edema，PPE）以及人類食道癌等人畜疾病有關［8］。另外，伏馬毒素還是一種慢性促癌劑，并能引起靈長類動物的動脈粥樣硬化樣改變。FBs由于分布廣泛且毒性較大，因此它在食品安全檢測中越來越受到人們的重視。國際上認為FBs是一種具有重大衛生學意義的真菌毒素，已形成繼黃曲霉毒素之后的又一個研究熱點［4］。目前國際上對于食品與飼料中伏馬毒素的限量及檢測方法尚無統一標準。如歐盟規定嬰幼兒玉米制品中FB（含FB1和FB2）的總含量為0.2mg/kg，玉米中的限量值為4mg/kg；美國食品及藥物管理局（food and drug administration，FDA）規定玉米中FB1、FB2和FB3總量的最高限量值為2mg/kg；而我國雖然制定了玉米和玉米飼料中伏馬毒素的高效液相色譜檢驗方法，但尚無明確的限量規定［5］。釀造啤酒原料（主要是谷物、水果等）中產毒真菌在一定的條件下產生、積累形成的伏馬毒素從而污染啤酒。基于食品安全的監管、控制，建立啤酒中FB1、FB2和FB3的可靠、快捷檢測方法，可為促進啤酒安全提供必要的技術支撐。

伏馬毒素的檢測方法主要有薄層色譜法、近紅外光譜法、酶聯免疫吸附法［9-11］、氣相色譜法、氣相色譜-質譜聯用法、高效液相色譜法、液相色譜-串聯質譜法等［12-15］。其中薄層色譜法和近紅外光譜法靈敏度和重現性較差，而酶聯免疫吸附法假陽性率高，不能滿足實驗室定量分析要求。以氣相色譜技術為基礎對目標物進行檢測時需要通過水解產生丙三羧酸和利用氨基衍生增強揮發度等步驟［16-17］。由于FB沒有紫外吸收也不含熒光基團，用HPLC法需要柱前衍生。液相色譜-串聯質譜法具有較高的選擇性和靈敏度，無需水解和衍生，避免了樣品基質的干擾、衍生產物的不穩定性和反應不完全等問題，因此本研究建立了免疫親和層析柱（immnuoaffinity chromatography columns，IAC）凈化-超高效液相色譜串聯質譜（ultra performance liquid chrom atography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）法測定啤酒中伏馬毒素FB1、FB2和FB3的含量，為了解啤酒中伏馬毒素污染水平提供技術方法。

1　材料與方法

1.1料與試劑

樣品啤酒：購于超市；質量濃度50μg/m L伏馬毒素（FB1、FB2、FB3）：Romer國際貿易（北京）有限公司；超純水：實驗室自制；甲醇、甲酸、乙酸（均為色譜純）：天津科密歐化學試劑有限公司。

吐溫-20/磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer solution，PBS）的配制：稱取8.0 g氯化鈉，0.2 g氯化鉀，1.2 g磷酸氫二鈉和0.2 g磷酸二氫鉀溶于990m L水中，用鹽酸∶水=50∶50（V/V）調節溶液的pH值至7.0，加入1.0m L吐溫-20，用超純水定容至1.0 L，混勻。

1.2器與設備

Ultimate 3000超高壓液相色譜儀、TSQ Quantum ultra三重四極桿質譜儀：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；TG16-WS臺式高速離心機：Sigma中國有限公司；TTL-DCⅡ型氮吹儀：北京同泰聯科技發展有限公司；艾科浦Aquaplus超純水機：上海百特科技有限公司；伏馬毒素免疫親和柱：美國維康公司。

1.3法

1.3.1品提取與凈化

樣品提取：稱取10 g（精確至0.001 g）樣品于50m L聚丙烯刻度離心管中，超聲脫氣15min，用吐溫-20/PBS緩沖溶液稀釋至40m L，混勻，稀釋液待凈化。

樣品凈化：待伏馬毒素免疫親和柱中的液體流至篩板時，將上述樣品稀釋液過伏馬毒素免疫親和柱，用10 m L吐溫20/PBS緩沖溶液淋洗免疫親和柱，棄去全部流出液，排干免疫親和柱中的水，用3m L 2%乙酸甲醇溶液分3次洗脫免疫親和柱，收集的洗脫液于60℃氮吹至干，加入1.0m L，甲醇∶0.1%甲酸水=10∶90（V/V）溶解殘留物，渦旋混勻10 s，過0.22μm的濾膜，上機測定。

1.3.2譜條件

超高效液相色譜條件：HypersilGold-C18色譜柱（150mm× 2.1mm×1.9μm），柱溫：30℃，進樣體積：10μL，流動相：0.1%甲酸水溶液-甲醇，流速0.3m L/m in，梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫條件Table 1 Conditions of gradient elution

質譜條件：電噴霧（electronic spray ion，ESI）離子源，噴霧電壓3 200 V，毛細管溫度300℃，蒸發溫度240℃，鞘氣270 kPa，輔助氣104 kPa，碰撞氣0.2 Pa，多反應監測（multiple reactionmonitoring，MRM）優化參數見表2。

表2質譜參數Table 2 The param eters ofmass spectrum

1.3.3準曲線的繪制及樣品中伏馬毒素的檢測

用空白基質將伏馬毒素標準貯備液稀釋成2.5 ng/m L、5.0 ng/m L、10.0 ng/m L、20.0 ng/m L、40.0 ng/m L、60.0 ng/m L、80.0 ng/m L、100.0 ng/m L標準系列溶液，在1.3.2色譜條件下進行分析，以伏馬毒素質量濃度（x）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標繪制標準工作曲線，得出標準曲線回歸方程。

將樣品的峰面積帶入標準曲線回歸方程，計算樣品中伏馬毒素的含量。

1.3.4密度及準確度實驗

取質量濃度為10.0 ng/m L的伏馬毒素混合標準溶液在1.3.2色譜條件下進行分析，連續測定6次，計算儀器精密度相對標準偏差。

在10 g空白啤酒樣品中添加伏馬毒素混合標準溶液，使添加水平分別為1μg/kg、8μg/kg，按照1.3.1樣品提取與凈化方法進行樣品前處理，在1.3.2色譜條件下進行分析，每個添加水平平行測定6份，計算方法平均回收率和相對標準偏差。

2　結果與分析

2.1準曲線與定量限

按照標準曲線的制作方法，以伏馬毒素質量濃度（x）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標繪制標準工作曲線，結果見圖1。

圖1 伏馬毒素FB1（A）、FB2（B）和FB3（C）標準曲線Fig．1 Standard curve of FB1（A），FB2（B）and FB3（C）

由圖1可知，FB1、FB2和FB3標準曲線的線性回歸方程分別為y=4462.4x+478.6（R2=0.9998）、y=13 465.6x+3036.3（R2=0.999 4）、y=7982.2x-2 709.4（R2=0.999 1）。結果表明，二者線性關系良好。以10 S/N計算方法的定量限分別為FB1（0.3μg/kg）、FB2（0.3μg/kg）和FB3（0.6μg/kg）。

2.2標回收率實驗

在空白啤酒樣品中加入1μg/kg、8μg/kg的伏馬毒素標準品，每個添加量做3次平行樣，方法的加標回收率結果見表3。

表3　加標回收率試驗結果Table 3 Results of the recovery rate tests

由表3可知，方法的平均回收率在88.3%～95.1%，相對標準偏差（relativestandard deviation，RSD）在4.5%～8.1%，結果表明該方法準確度較高。

2.3密度實驗

取質量濃度為10.0 ng/m L的伏馬毒素標準溶液在1.3.2色譜條件下進行分析，連續測定6次，FB1、FB2和FB3測定結果相對標準偏差（RSD）分別為0.9%、1.4%、1.7%，結果表明該方法精密度較好。

2.4UPLC-MS/MS檢測樣品中伏馬毒素

本研究選擇甲醇-含0.1%甲酸水溶液作為流動相，進行二元梯度洗脫，FB2和FB3兩種同分異構體能達到基線分離（分離度為2.2），出峰順序依次為FB1、FB3和FB2，獲得標準品和樣品的MRM分別見圖2及圖3。

圖2 伏馬毒素標準品的MRM圖譜Fig．2 MRM chromatogram s of fumonisin standard

圖3伏馬毒素樣品的MRM圖譜Fig.3 MRM chromatogram s of fumonisin samples

隨機抽取14種不同品牌的16份啤酒樣品，測定其FB1、FB2和FB3的含量，其中有3份檢測出伏馬毒素，有1份均檢出FB1、FB2和FB3，含量分別為36.5μg/kg、4.73μg/kg、1.79μg/kg；有2份檢出FB1和FB2，FB1含量分別為15.5μg/kg、13.7μg/kg，FB2的含量分別為2.41μg/kg、2.24μg/kg，其余13份啤酒樣品均未檢出伏馬毒素，但檢出伏馬毒素的3份樣品都含有玉米原料，這可能與玉米最易受伏馬毒素的污染有關。

3　結論

本研究采用了免疫親和柱凈化-超高效液相色譜串聯質譜法測定啤酒中FB1、FB2和FB3含量。使用超高液相檢測靈敏度比普通高效液相色譜法高，消耗的有機溶劑少，檢測速度快，適用于大批量樣品的監測。使用高靈敏度的質譜檢測器，有效的減少基質對伏馬毒素FB1、FB2和FB3測定的干擾，無需液相測方法的衍生化。該方法專屬性強、線性范圍寬、平均回收率為88.3%～95.1%，標準偏差為4.5%～8.1%，精密度實驗結果相對標準偏差為0.9%～1.7%，該方法準確度高、精密度好，可為啤酒中伏馬毒素的風險評價提供快速、靈敏、準確的分析方法。

［1］RHEEDER JP，MARASASW FO，VISMERH F.Produetion of fumonisin analogsby Fusarium species［J］.APPl Env M icrobiol，2002，68（5）: 2101-2105.

［2］徐經杰，李森，胡斌.糧食中伏馬毒素B1、B2的免疫親和凈化超高效液相色譜測定［J］.糧食科技與經濟，2014，39（6）：31-35.

［3］SEO JA，PROCTOR R H，PLATTNER R D.Characterization of four clustered and coregulated genes associated w ith fumonisin biosynthesis in Fusarium verticillioides［J］.Fungal Genet Biol，2001（34）:155-165.

［4］劉承蘭，許文娜，AndreasKofoet，等.液相色譜-電噴霧串聯質譜法測定食品中的伏馬菌素［J］.分析化學，2005，33（11）：1619-1622.

［5］崔曉娜，李舫，王洪濤，等.高效液相色譜串聯質譜測定糧谷及飼料中玉米赤霉烯酮及其代謝物和伏馬毒素B1、B2［J］.中國畜牧雜志，2015，51（4）：62-66.

［6］楊俊花，劉峰良，楊海峰，等.伏馬毒素毒性作用的研究進展［J］.上海農業學報，2015，31（2）：142-146.

［7］李正翔，陳小龍，曹趙云，等.液相色譜-串聯質譜法測定糧谷中的伏馬毒素［J］.分析測試學報，2014，33（2）：167-172.

［8］郭耀東，劉藝茹，袁亞宏，等.我國主要食品中伏馬菌素污染水平分析與風險評估［J］.西北農林科技大學學報，2014，42（1）：78-88.

［9］曹婭，孫利，王明林，等.糧谷中8種痕量真菌毒素的定量分析方法［J］.分析測試學報，2013，32（2）：150-155.

［10］王雨晨，王君，王元凱，等.伏馬毒素B1單克隆抗體的制備及間接競爭ELISA方法的建立［J］.上海交通大學學報，2011，29（2）：69-74.

［11］江濤，宮慧之，李鳳琴，等.抗伏馬菌素B1單克隆抗體的制備及試劑盒的研制［J］.衛生研究，2006（2）：209-212.

［12］朱益波，李胤.啤酒中伏馬菌素的測定［J］.啤酒科技，2005（10）：72-74.

［13］曹佳璐，張曉旭，馬麗艷.酒中伏馬菌素的研究進展［J］.中國釀造，2011，30（9）：8-10.

［14］李為喜，鄭床木，武力，等.測定玉米中伏馬毒素的免疫親和層析凈化高效液相色譜法［J］.作物學報，2012，38（3）：556-562.

［15］潘紅鋒，任一平，賴世云，等.應用串聯液質技術檢測玉米中伏馬菌毒素的研究［J］.中國衛生檢驗雜志，2009，19（3）：467-470，490.

［16］權英，王碩，韓英素，等.高效液相色譜法檢測玉米中的伏馬毒素B1和B2［J］.食品與發酵工業，2005，31（8）：87-90.

［17］鄭鐵松，鐘文輝.高效液相色譜法測定食品中的伏馬毒素［J］.食品科學，2004，25（3）：135-138.

Determ ination of fumonisin contents in beerby UPLC-MS/MS

ZHOU Yibing1，WU Kun2，LILei1，LIN Ye1，LIU Liya1*
（1.Guizhou Provincial CenterforDiseases Controland Prevention，Guiyang 550004，China；2.SchoolofChemistry and Life Sciences，Guizhou NormalCollege，Guiyang 550018，China）

Amethod for FB1，FB2and FB3determ ination in beerwasestablished by immuneaffinity column purification-ultraperformance liquid chromatography tandem mass spectrometry.Compared w ith liquid chromatogram，themethod avoided the effects of derivative efficiency（including derivatives instability，derivating agent concentration，temperature，reaction time，etc.）on chem ical derivatization.By multiple reactionmonitoring mode for detection，three kindsof substanceshad a good linear relationship in 2.5-100 ng/m l range，and the correlation coefficient R2were allmore than 0.999.Adding fumonisin 1.0μg/kg and 8.0μg/kg into theblank samples，resultsshowed that theaverage recovery ratewas88.3%-95.1%，RSD was4.5%-8.1%，lim itofquantitation were allbelow 0.6μg/kg.RSD of precision experimentswas0.9%-1.7%.Themethod wasw ith high accuracy and good precision，and itwas suitable for fumonisin contents determ ination in beer，which could provide a reference basis for risk assessmentdata sourcesof fumonisin in beer.

UPLC-MS/MS；fumonisin；determ ination；beer

O657．63

0254-5071（2016）01-0152-04

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．01．034

2015-11-08

貴州省科學技術基金項目（黔科合J字［2009］2240）

周貽兵（1985-），男，副主任技師，碩士，研究方向為食品分析。

劉利亞（1978-），男，副主任技師，本科，研究方向為食品分析。