培養(yǎng)條件對(duì)金黃色葡萄球菌-大腸桿菌混合生物被膜的影響

劉晶晶，陳晶瑜

培養(yǎng)條件對(duì)金黃色葡萄球菌-大腸桿菌混合生物被膜的影響

劉晶晶，陳晶瑜*

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083）

以常見食源性致病菌金黃色葡萄球菌和大腸桿菌為研究對(duì)象，采用微孔板法對(duì)混合生物被膜形成過程中的不同影響因素進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：在25℃或30℃條件下，采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.8%的胰酶大豆肉湯（TSB）或0.8%的腦心浸出液（BHI）培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)，生物被膜形成量較高；添加適量的葡萄糖、乳糖、麥芽糖和蔗糖可提高混合生物被膜形成能力；培養(yǎng)基中NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞8%時(shí)，混合生物被膜的生長明顯受到抑制。

金黃色葡萄球菌；大腸桿菌；雙菌種生物被膜；培養(yǎng)條件

生物被膜（biofilm，BF）是指粘附于接觸表面，分泌胞外多聚物，將其自身包圍其中而形成的微生物群落［1］。在食品生產(chǎn)環(huán)境中，生物被膜一旦形成，常規(guī)消毒方法可能無法對(duì)其進(jìn)行有效清除，而生物被膜中的細(xì)胞一旦脫離，就會(huì)發(fā)生食品交叉污染，因此給食品安全帶來極大威脅［2］。

在自然條件下，大多數(shù)生物被膜是由多種微生物組成的混合生物被膜，這增加了不同菌種之間的相互作用和胞外分泌物的復(fù)雜性，從而改變生物被膜菌種的生理特性以及整個(gè)被膜的功能［3］。有研究表明，由單增李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）和植物乳桿菌（Lactobacillus plantaru）形成的混合生物被膜，其對(duì)消毒劑的抵抗能力比浮游態(tài)和單一菌株生物被膜態(tài)強(qiáng)［3］。ADAMB等［4］報(bào)導(dǎo)，在白色念珠菌（Candida albicans）與表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）形成的混合菌種生物被膜中，表皮葡萄球菌分泌的胞外多聚物能有效抑制抗真菌藥物氟康唑的滲透，并為不產(chǎn)粘液的白色念珠菌形成保護(hù)膜。由此可見，食品加工環(huán)境中非生物表面上食源性病原菌混合生物被膜的研究是至關(guān)重要的。

影響生物被膜形成的因素有很多，而營養(yǎng)供應(yīng)和環(huán)境條件被認(rèn)為是調(diào)控微生物粘附行為以及生物被膜形成的重要因素。如在HAMANAKA D等［5］的實(shí)驗(yàn)中，假單胞菌生物被膜明顯受到培養(yǎng)溫度和營養(yǎng)水平的影響。NGUYEN D等［6］在其研究中提出，可將生物被膜的生長溫度和pH作為柵欄因子從而達(dá)到控制生物被膜形成的目的。此外，靳嘉巍等［7］研究了葡萄糖對(duì)生物被膜誘導(dǎo)的分子機(jī)制，研究結(jié)果表明葡萄糖可能是通過誘導(dǎo)表皮葡萄球菌ica基因的表達(dá)和多聚β-1，6-2-脫氧-2-氨基-D-吡喃葡萄糖（PIA）的合成，促進(jìn)生物被膜的形成。邢盼盼［8］對(duì)食品加工設(shè)備中金黃色葡萄球菌生物被膜的研究表明，麥芽糖對(duì)生物被膜的形成有微弱的誘導(dǎo)作用。由此可見，探究一些常見的環(huán)境條件參數(shù)對(duì)混合生物被膜形成的影響，可為探索食品生產(chǎn)過程中生物被膜的控制方法提供一定理論依據(jù)。本研究考察了不同培養(yǎng)條件對(duì)兩種常見食源性病原菌（大腸桿菌與金黃色葡萄球菌）混合生物被膜形成的影響，以期了解混合生物被膜的特性并為建立混合生物被膜的控制方法提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌株

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC 6538：購自中國普通微生物菌種保藏管理中心；大腸桿菌（Escherichia coli）：分離自北京市某農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)生肉區(qū)，本研究室分離、鑒定并保藏。

1.1.2試劑

蔗糖、麥芽糖、乳糖、葡萄糖、氯化鈉、磷酸氫二鉀、磷酸氫二鈉、結(jié)晶紫、草酸銨、甲醇、冰醋酸（均為分析純）：北京北化精細(xì)有限責(zé)任公司。

1.1.3培養(yǎng)基

胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（tryptic soy broth，TSB）：胰蛋白胨17 g/L，大豆蛋白胨3 g/L，氯化鈉5 g/L，磷酸氫二鉀2.5 g/L，葡萄糖2.5 g/L。腦心浸出液培養(yǎng)基（brain-heart infusion medium，BHI）：蛋白胨10 g/L，脫水小牛腦浸粉12.5 g/L，脫水牛心浸粉5 g/L，氯化鈉5 g/L，葡萄糖2 g/L，磷酸氫二鈉2.5 g/L。

1.2儀器與設(shè)備

Wellscan MK3酶標(biāo)儀：美國熱電有限公司；YW30Z高壓濕熱滅菌鍋：北京科瑞科學(xué)儀器材有限公司；LHR-150（F）生化培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；YT-CJ-2ND型潔凈工作臺(tái)：亞泰科隆儀器技術(shù)有限公司。

1.3方法

1.3.1種子液制備

將金黃色葡萄球菌和大腸桿菌活化后分別接種于TSB培養(yǎng)基中，37℃、120 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)至OD600nm約為1.0左右，制成種子液備用［9］。

1.3.2雙菌種混合生物被膜的培養(yǎng)

首先向96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔添加200 μL制備好的無菌培養(yǎng)基，金黃色葡萄球菌和大腸桿菌菌液按照體積比1∶1混勻后以1%的接種量進(jìn)行接種。最后，將接種的孔板分別置于25℃、30℃、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，每一實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組設(shè)置3個(gè)平行，對(duì)照孔只加無菌培養(yǎng)基，每24 h更換一次新鮮培養(yǎng)基。

1.3.3結(jié)晶紫染色法對(duì)混合生物被膜形成能力的檢測(cè)

培養(yǎng)結(jié)束后，棄去培養(yǎng)基，并用300 μL無菌磷酸鹽緩沖液沖洗3次，洗去浮游菌體和雜質(zhì)；然后于每孔中添加200μL無水甲醇固定15min，隨后將懸浮液移去，并于60℃烘箱中干燥固定1 h；于每孔中添加2%的結(jié)晶紫200 μL染色20 min，用自來水沖洗干凈，干燥；每孔添加體積分?jǐn)?shù)為33%的冰醋酸300 μL，室溫靜置10 min；在波長630 nm處測(cè)定吸光度值［10］，吸光度值可反映生物被膜的形成能力，其值高于0.24均被認(rèn)為可形成較厚的生物被膜［11］。

1.3.4培養(yǎng)基質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)混合生物被膜形成能力的影響

分別配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%、0.4%、0.8%、1.6%、3.2%、 6.4%的TSB和BHI培養(yǎng)基，每孔添加200 μL上述培養(yǎng)基，培養(yǎng)方式和混合生物被膜形成能力的檢測(cè)如上所述，每一實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組設(shè)置三個(gè)平行，對(duì)照孔只加無菌培養(yǎng)基，每24 h更換一次新鮮培養(yǎng)基［12］。

1.3.5 NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)混合生物被膜形成能力的影響

分別配制含NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0、2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%的（3%，w/w）TSB培養(yǎng)基，每孔分別添加200 μL上述培養(yǎng)基，培養(yǎng)方式和混合生物被膜形成能力的檢測(cè)如上所述，平行試驗(yàn)3次［13］。

1.3.6單一碳源對(duì)混合生物被膜形成能力的影響

為研究食品加工廠中常見碳源對(duì)混合生物被膜形成能力的影響，首先配制含不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%葡萄糖的（3%，w/w）TSB培養(yǎng)基，每孔添加200μL培養(yǎng)，培養(yǎng)方式和混合生物被膜形成能力的檢測(cè)如上所述，平行試驗(yàn)3次，再以蔗糖、麥芽糖和乳糖替換葡萄糖來配制不同糖含量的TSB培養(yǎng)基（糖含量和生物被膜培養(yǎng)方式同上）檢測(cè)不同糖分對(duì)生物被膜形成能力的影響［14］。

1.3.7數(shù)據(jù)分析

采用Origin 8.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2　結(jié)果與分析

2.1不同培養(yǎng)溫度下培養(yǎng)基質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)混合生物被膜形成能力的影響

在食品工廠中生長的細(xì)菌經(jīng)常處于波動(dòng)的營養(yǎng)環(huán)境中，而營養(yǎng)供應(yīng)被認(rèn)為是調(diào)控微生物黏附行為以及生物被膜形成的重要因素。HAMANAKA D等［5］對(duì)假單胞菌生物被膜的研究顯示，單菌種生物被膜在20倍稀釋的TSB培養(yǎng)基中比正常濃度的TSB培養(yǎng)基中生長狀況好。因此，本研究分別測(cè)定了TSB質(zhì)量分?jǐn)?shù)和BHI含量對(duì)混合生物被膜形成能力的影響，結(jié)果（見圖1）可知，在兩種培養(yǎng)基條件下混合生物被膜的形成呈現(xiàn)出相同的趨勢(shì)，即在較低培養(yǎng)溫度（25℃或30℃）下，當(dāng)培養(yǎng)基質(zhì)量分?jǐn)?shù)由0.2%增加至0.8%時(shí)，混合生物被膜活菌數(shù)呈上升趨勢(shì)，隨后，隨著培養(yǎng)基質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高被膜形成量下降。這說明混合生物被膜在貧營養(yǎng)條件下生長較好，推測(cè)可能是由于貧營養(yǎng)條件給細(xì)菌造成了一個(gè)脅迫環(huán)境，導(dǎo)致細(xì)菌更加傾向于呈生物被膜態(tài)生長，最終處于相對(duì)安全的環(huán)境。所不同的是，在37℃條件下，隨TSB含量增加，混合生物被膜生長呈現(xiàn)出先減少后增加的趨勢(shì)；而在37℃下BHI環(huán)境中，混合生物被膜生長狀況與培養(yǎng)基質(zhì)量分?jǐn)?shù)卻沒有顯著的相關(guān)性。可能在不同溫度下，微生物形成被膜的最適營養(yǎng)濃度不同，而且混合生物被膜對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)具有一定的選擇性。由此得出，在25℃或30℃條件下，TSB和BHI培養(yǎng)基質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8%時(shí)混合生物被膜生長較好，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.2%～6.4%時(shí)，混合生物被膜被有效抑制。

圖1　不同培養(yǎng)溫度下TSB（A）和BHI（B）質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)混合生物被膜形成能力的影響Fig.1 Effect of TSB（A）and BHI（B）concentration on OD600nmof mixed-species biofilm at different culture temperature

2.2不同培養(yǎng)溫度下NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)混合生物被膜形成能力的影響

由于生物被膜在非生物表面的形成給食品工業(yè)造成了重大隱患，因此控制生物被膜的生長對(duì)食品工廠至關(guān)重要。高濃度NaCl溶液可以產(chǎn)生滲透壓，讓細(xì)菌細(xì)胞脫水，導(dǎo)致其失水死亡，由此推斷NaCl溶液可以有效抑制生物被膜的生長。因此，本實(shí)驗(yàn)研究了NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)混合生物被膜的影響，以期為開發(fā)安全有效的生物被膜清除方案提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。不同溫度下NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)混合生物被膜形成能力的影響結(jié)果見圖2。由圖2可知，隨著NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高，混合生物被膜的形成量逐漸下降，當(dāng)NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞8%時(shí)，不同培養(yǎng)溫度下金黃色葡萄球菌和大腸桿菌混合生物被膜的生長均受到明顯抑制。這一結(jié)果與單一菌種生物被膜的研究數(shù)據(jù)很相近；鄧旗等［13］研究報(bào)道，當(dāng)NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%時(shí)，希瓦氏菌幾乎不能形成生物被膜。由此可見，一定含量的NaCl可以十分有效地抑制生物被膜的形成。此外，較低溫度條件下（25℃或30℃），NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞2%時(shí)，混合生物被膜的生長受到明顯抑制。由此可見，在食品工業(yè)中，若有條件使用較高濃度的NaCl溶液來清洗食品接觸面并結(jié)合環(huán)境溫度，可以有效預(yù)防生物被膜的形成。

圖2　不同培養(yǎng)溫度下NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)混合生物被膜形成能力的影響Fig.2 Effect of sodium chloride concentration on OD600nmof mixed-species biofilm at different culture temperature

圖3　不同培養(yǎng)溫度下麥芽糖（a），葡萄糖（b），乳糖（c），蔗糖（d）質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)混合生物被膜形成能力的影響Fig.3 Effect of maltose（a），glucose（b），lactose（c），sucrose（d）concentration on OD600nmof mixed-species biofilm at different culture temperature

2.3單一碳源對(duì)混合生物被膜形成能力的影響

碳源是調(diào)控微生物黏附行為以及生物被膜形成的重要因素，對(duì)于控制生物被膜的形成有著重要意義［15］。在單一菌種生物被膜的研究中曾顯示，簡單碳源在特定的濃度條件下可對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜的生長有微弱或較強(qiáng)的誘導(dǎo)作用［16］。為了了解混合生物被膜在不同碳源條件下的特性，研究了食品中四種常見碳源（麥芽糖、葡萄糖、乳糖、蔗糖）在不同溫度下對(duì)混合生物被膜形成能力的影響，結(jié)果（見圖3）可知，不同溫度下混合生物被膜的形成量隨糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加而呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，說明這四種常見的簡單碳源均對(duì)混合菌種生物被膜的形成有促進(jìn)作用。此外，在25℃條件下，麥芽糖和乳糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)由0.2%增至1.4%時(shí)，混合生物被膜形成較快，但在此濃度范圍內(nèi)，隨著葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，混合生物被膜生長呈現(xiàn)緩慢上升的趨勢(shì)，而蔗糖對(duì)混合生物被膜的形成沒有顯著影響；在30℃條件下，麥芽糖、葡萄糖和乳糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)由0.6%增至1.4%時(shí)，混合生物被膜形成較快，而在此濃度范圍內(nèi)，蔗糖略微促進(jìn)混合生物被膜形成，并在蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%時(shí)，混合生物被膜形成能力最強(qiáng)（OD600nm為0.6）；在37℃條件下，麥芽糖和乳糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0至1.4%范圍內(nèi)，隨著糖含量增加，能促進(jìn)混合生物被膜形成；而隨著葡萄糖和蔗糖濃度增加，混合生物被膜呈現(xiàn)波動(dòng)上升的趨勢(shì)。由此揭示，從“防重于治”的觀點(diǎn)來看，在食品工業(yè)中，應(yīng)盡量清除殘留在加工環(huán)境中的糖成分，以防止誘導(dǎo)病原微生物生物被膜的形成。

3　結(jié)論

培養(yǎng)基成分、溫度、鹽含量、糖含量等因素均能顯著影響金黃色葡萄球菌和大腸桿菌混合生物被膜的生長。在25℃或30℃條件下，TSB和BHI培養(yǎng)基質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8%時(shí)混合生物被膜生長較好；在25℃、30℃或37℃條件下，NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%時(shí)能有效抑制生物被膜形成。而不同溫度下，簡單碳源均對(duì)混合菌種生物被膜的形成均有促進(jìn)作用。因此在食品工業(yè)中如牛奶廠、甘蔗汁廠、麥芽糖生產(chǎn)廠等，要結(jié)合生產(chǎn)食品的差異性，選擇有效的手段控制混合生物被膜的生長，盡可能對(duì)加工設(shè)備及時(shí)清理，減少食品接觸表面各種糖分的殘留量，從而避免對(duì)微生物提供生長的溫床，降低損失。

［1］HALL-STOODLEY L，COSTERTON J W，STOODLEY P.Bacterial biofilms-from the natural environment to infectious diseases［J］.Nat Rev Microbiol，2004，2（2）：95-108.

［2］RODE T M，LANGSRUD S，HOLCK A，et al.Different patterns of biofilmformationinStaphylococcusaureusunder food-related stressconditions［J］.Int J Food Microbiol，2007，116（3）：372-383.

［3］VEEN S V D，ABEE T.Mixed species biofilms ofListeria monocytogenesandLactobacillus plantarumshow enhanced resistance to benzalkonium chloride and peracetic acid［J］.Int J Food Microbiol，2011，144（3）：421-431.

［4］ADAM B，BAILLIE G S，DOUGLAS L J.Mixed species biofilms of Candida albicansandStaphylococcus epidermidis［J］.J Med Microbiol，2002，51（4）：344-349.

［5］HAMANAKA D，ONISHI M，GENKAWA T，et al.Effects of temperature and nutrient concentration on the structural characteristics and removal of vegetable-associatedPseudomonasbiofilm［J］.Food Control，2012，24：165-170.

［6］NGUYEN D，JOSHI-DATAR A，LEPINE F，et al.Active starvation responses mediate antibiotic tolerance in biofilms and nutrient-limited bacteria［J］.Science，2011，334（6058）：982-986.

［7］靳嘉巍，張力，查錫良，等.葡萄糖對(duì)表皮葡萄球菌生物被膜形成的影響及調(diào)節(jié)機(jī)制的研究［J］.微生物學(xué)報(bào)，2005，45（3）：431-436.

［8］邢盼盼.食品加工設(shè)備中金黃色葡萄球菌生物被膜研究［D］.廣州：仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，2013.

［9］KELLY D，MCAULIFFE O，ROSS R P，et al.Prevention ofStaphylococcus aureusbiofilm formation and reduction in established biofilm density using a combination of phage K and modified derivatives［J］.Lett Appl Microbiol，2012，54（4）：286-291.

［10］LEE J H，KIM Y G，RYU S Y，et al.Ginkgolic acids andGinkgo biloba extract inhibitEscherichia coliO157：H7 andStaphylococcus aureus biofilm formation［J］.Int J Food Microbiol，2014，174：47-55.

［11］CASTELIJN G A，VAN D V S，ZWIETERING M H，et al.Diversity in biofilm formation and production of curli fimbriae and cellulose of Salmonella typhimuriumstrains of different origin in high and low nutrient medium［J］.Biofouling，2012，28（1）：51-63.

［12］段韻涵，韓北忠，楊葆華，等.培養(yǎng)條件對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜生長的影響［J］.中國釀造，2008，27（3）：17-20.

［13］鄧旗，孫力軍，王雅玲，等.環(huán)境條件對(duì)腐敗希瓦氏菌生物被膜形成能力的影響［J］.中國食品學(xué)報(bào)，2013，13（10）：43-50.

［14］郭陽.不同濃度葡萄糖對(duì)銅綠假單胞菌生物膜形成影響的研究［D］.太原：山西醫(yī)科大學(xué)，2013.

［15］任曉萍，楊蓉婭，樊昕，等.真菌生物膜影響因素的研究進(jìn)展［J］.中國真菌學(xué)雜志，2009，4（3）：183-185.

［16］毛巍.牛乳中金黃色葡萄球菌生物被膜形成條件的研究［D］.呼和浩特：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.

Effects of culture conditions on the growth of dual-species biofilm formed byStaphylococcus aureusandEscherichia coli

LIU Jingjing，CHEN Jingyu*
（College of Food Science&Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China）

Effects of different factors on the growth of dual-species biofilm，which was formed by the most common foodborne pathogenic bacterial Staphylococcus aureusandEscherichia coli，were studied by microtiter-plate method.The results showed thatS.aureusandE.coliformed high quality biofilms at 25℃or 30℃in 0.8%TSB or BHI medium.The addition of glucose，lactose，maltose，and sucrose improved the growth of the dual-species biofilm，respectively.The formation ability of dual-species was significantly inhibited by adding sodium chloride more than 8%.

Staphylococcus aureus；Escherichia coli；dual-species biofilm；culture condition

TS201.3

0254-5071（2016）07-0020-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.07.005

2016-01-19

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31371716）；北京高等學(xué)校青年英才計(jì)劃項(xiàng)目（YETP0310）

劉晶晶（1990-），女，博士研究生，研究方向?yàn)槊腹こ獭?/p>

陳晶瑜（1978-），女，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称肺⑸飳W(xué)。