新疆塔城地區哈薩克族傳統奶酪中酵母菌的分離鑒定

蘆文娟，李寶坤，盧士玲

新疆塔城地區哈薩克族傳統奶酪中酵母菌的分離鑒定

蘆文娟，李寶坤*，盧士玲

（石河子大學 食品學院，新疆 石河子 832000）

為保護新疆哈薩克族傳統奶酪中的優良酵母菌株，從新疆塔城牧區不同牧場采集的10份哈薩克族傳統奶酪樣品中，分離得到44株酵母菌。采用形態學、生理生化特性鑒定、5.8SrDNA序列同源性分析相結合的方法，對分離菌株進行鑒定。共鑒定出5個種，其中34株庫德畢赤酵母（Pichia kudriavzevii），為優勢菌株，6株戴爾有孢圓酵母（Torulaspora delbrueckii），2株乳酸克魯維酵母（Kluyveromyces lactis），1株馬克思克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus），1株發酵畢赤酵母（Pichia fermentans）。結果表明，哈薩克族傳統奶酪制品中所含酵母菌與其他地區的存在差異性，有其獨特的酵母菌資源。

奶酪；奶酪；酵母菌；分離鑒定

新疆屬溫帶大陸性干旱氣候，年溫差與日溫差極大，在降水和氣溫方面，地區的差異也非常顯著［1］，新疆也是中國四大牧場之一，世代生存游牧民族，有很多的少數民族，他們一直保留著自制并食用傳統發酵乳制品的習慣，使得新疆傳統發酵乳制品具有鮮明的地域特點。奶酪就是各族少數民族非常喜歡食用一類自制發酵乳制品。奶酪具有獨特的風味，不僅能夠增強人體的抵抗力，還能夠促進機體新陳代謝，增強活力；膽固醇含量較低，對心血管健康有一定的益處；同時奶酪還是含鈣最多的奶制品，這些鈣類也較易被吸收［2］。當地居民沿用古老而傳統的方法生產發酵奶酪，這種原生態的制作方法，較好地保留了發酵乳制品的風味，富含了當地自然環境中的豐富的微生物資源，營養價值高，并具有較好的益生作用［3］。
但隨著工業化的發展，游牧生活日漸減少，這種傳統發酵乳制品的制作也隨之減少，其中富含的豐富微生物資源面臨丟失的困境。近幾年，許多學者對新疆傳統發酵乳制品中的微生物進行了研究，但傳統發酵乳制品中對酵母菌種的研究相對乳酸菌還非常少，并且由于所采樣品地區和民族之間的差異，使分離得到的微生物種類和數量存在較大的差異性［4］。

本研究以新疆塔城牧區哈薩克族傳統奶酪為原料，采用形態學、生理生化特性、5.8S rDNA序列同源性分析相結合的方法對分離菌株進行鑒定，并對奶酪中酵母菌的分布和種類的多樣性進行分析。不僅能夠系統地收集和保存新疆塔城牧區哈薩克族傳統奶酪中的酵母菌，豐富我國的酵母菌資源；也有利于更加深入準確地了解酵母菌種資源在傳統發酵乳制品中的分布。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1樣品來源

新疆哈薩克族奶酪：采自新疆塔城喀拉也木勒、烏宗布拉克、二道橋等10個牧場。

1.1.2培養基［5］

菌種的分離使用馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基，純化和保存使用酵母膏胨葡萄糖瓊脂（yeast extract peptone dextrose，YEPD）平板和斜面培養基。

鑒定用培養基使用Gorodkowa瓊脂培養基、氮源基礎培養基、碳源基礎培養基、糖發酵基礎培養基、產酸基礎培養基、產酯基礎培養基、產類淀粉培養基。

1.1.3主要試劑

酵母菌基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）、2xTaq PCR MasterMix：天根生化科技有限公司；GoldView核酸染色劑：北京索萊寶科技有限公司；引物ITS1和ITS4：上海生工生物工程有限公司。

1.2儀器與設備

W-CJ-1Cg超凈工作臺：蘇州凈化設備有限公司；DNP-9272電熱恒溫培養箱：上海精宏試驗設備公司；5417R高速冷凍離心機：德國Eppendorf公司；LD2X-30KA立式電熱壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫療器械廠；COVER-015普通光學顯微鏡：日本OLYMPUS公司；TC-512聚合酶鏈反應（polymerase chainreaction，PCR）擴增儀：美國Techne公司。

1.3實驗方法

1.3.1酵母菌的分離與純化

取1 g奶酪樣品，溶于9 mL無菌水中，采取稀釋平板法涂于PDA培養基進行分離，平板置于25℃培養箱中培養36～48 h，觀察并記錄菌落特征，挑取不同形態單個菌落，進行簡單染色，觀察細胞形態，重復幾次純化酵母菌，直至鏡檢結果為同一細胞形態后，將其接種于YEPD固體斜面培養基上，25℃培養36～48 h后，于4℃保存備用。

1.3.2酵母菌的生理生化特性鑒定

酵母菌分離菌株主要通過繁殖方式觀察、子囊孢子形成實驗、擲孢子形成實驗、菌絲形成實驗、糖發酵實驗、碳源同化實驗、氮源同化實驗、類淀粉化合物生成實驗、產酯實驗、產酸實驗等生理生化特征進行鑒定［5-6］。

1.3.3酵母菌的5.8S rDNA分析

（1）酵母菌基因組DNA的提取

將上述純化的酵母菌接種于YEPD液體培養基中置于25℃培養36 h后，取1 mL活化菌懸液，12 000 r/min離心1 min，收集沉淀即為菌體。按照酵母菌基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）說明書上的方法進行操作，然后將所提取的DNA于-20℃保存。

（2）5.8S rDNA PCR擴增

將上述制備的基因組DNA作為PCR擴增的模板，使用引物ITS 1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS 4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）［7］對5.8S-ITS區域酵母菌DNA進行擴增；采用50μL反應體系：DNA模板2 μL，ITS1（10 μmol/L）2 μL，ITS4（10 μmol/L）2 μL，2xTaqPCR MasterMix 25 μL，加ddH2O補至50 μL。

PCR反應循環條件：95℃預變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，循環次數為35次；72℃延伸10 min。

PCR產物經1%的瓊脂糖凝膠進行電泳，電壓100 V，電泳液為1×TAE。電泳后，用GoldView染色20 min，紫外燈下觀察，拍照。

（3）擴增產物測序及系統發育分析

PCR產物經電泳檢測合格后，送往上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序，測得的序列在美國國家生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）數據庫中進行同源序列搜索，從數據庫獲得相關種屬的5.8S rDNA基因序列，采用軟件Mega5.0中的Neighbor-Joining方法與標準菌株基因序列進行比對，進行1 000次Bootstrap檢驗后構建系統發育樹。

2　結果與分析

2.1分離菌株形態特征

酵母菌在經YEPD培養基活化后，將分離菌株在普通光學顯微鏡下，觀察菌落和細胞形態。酵母菌菌落形態如圖1、表1所示，細胞形態和繁殖方式見表2。

圖1　分離酵母菌株菌落形態Fig.1 Colony morphology of isolated yeasts

由圖1和表1可知，采用傳統純培養分離的方法，從采集的10個奶酪樣品中，經過菌種的分離純化，共得到44株酵母菌，酵母菌菌落形態呈圓形或橢圓形，顏色呈乳白色或淡黃色，表面光滑或干燥，邊緣整齊，表面凸起，呈現半透明狀或不透明。由表2可知，分離菌株繁殖方式多為無性繁殖，且無菌絲或有假菌絲，細胞形態多為圓和橢圓形，細胞形態符合酵母菌特征。

表1　分離菌株的菌落形態鑒定結果Table 1 Identification results of colony morphology of isolated strains

續表

表2　分離菌株細胞形態和繁殖方式鑒定結果Table 2 Identification results of cell morphology and reproductive modes of isolated strains

2.2分離菌株的理化性質鑒定結果

酵母菌的理化性質鑒定結果見表3，碳源、氮源同化鑒定結果見表4。

表3　酵母菌的生理生化性質鑒定結果Table 3 Identification results of physiological and biochemical properties of yeasts

表4　碳源、氮源同化鑒定結果Table 4 Identification results of carbon and nitrogen source assimilation

由表3、表4可知，采用傳統形態學、生理生化特性方法對酵母菌進行鑒定，依據《酵母菌的特征與鑒定手冊》，根據實驗結果發現，分離株均為芽殖，有些有假菌絲，在發酵實驗中，除葡萄糖發酵外不發酵其他被檢糖，在碳源同化實驗中可同化乙醇和檸檬酸，氮源同化實驗中不能同化硝酸鹽，屬于畢赤氏酵母屬（Pichia）；部分分離菌株（如菌株4-2、4-5、7-1、9-3、9-4和9-6）葡萄糖發酵陽性，硝酸鹽還原、類淀粉物質的生成試驗陰性，屬于有孢圓酵母屬（Torulaspora）；還有部分菌株僅依據生理生化鑒定結果，無法對其種屬進行判斷。

2.3酵母菌的5.8S rDNA鑒定

2.3.1分離菌株5.8S rDNA PCR擴增結果

對44株酵母菌分離株進行分子生物學鑒定，PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測后，檢測結果如圖2所示。由圖2可知，在450～750 bp之間獲得特異性擴增條帶，符合酵母菌5.8S rDNA區理論預期值［8］，可初步鑒定為酵母菌。

圖2　分離菌株5.8S rDNA PCR擴增產物電泳圖Fig.2 PCR amplification products electrophoretogram of 5.8S rDNA of isolated strain

2.3.2基于5.8S rDNA基因序列的酵母菌株系統發育分析44株分離酵母菌的分子生物學鑒定結果如表5所示。

表5　44株酵母菌的ITS序列鑒定結果Table 5 Identification results of ITS sequence of 44 yeast strains

由表5可知，奶酪中的44株分離株，經鑒定屬于3屬5種，其中庫德畢赤酵母（P.kudriavzevii）為優勢菌株，占總分離菌株中的77%；其次為戴爾有孢圓酵母（Torulaspora delbrueckii）。

從44株分離菌株中挑選出生長較為旺盛、生理生化特征典型、具有代表性的15株分離菌株（1-1、2-1、3-5、4-2、 4-5、5-3、6-2、7-1、8-1、9-3、9-4、9-6、10-3、10-4、10-6），在NCBI序列數據庫中進行序列搜索，以比較分離出的酵母菌菌株與已知酵母菌菌株相應序列的相似程度，基于ITS區序列構建系統發育樹，如圖3所示。

圖3　15株分離菌株的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of 15 isolated strains

由圖3可知，分離菌株10-4與標準菌株的同源性為97%，根據酵母種類的劃分依據，同源相似率低于99%的，不能劃為同一個種［9］，但結合生理生化鑒定結果，可判斷此菌株為馬克斯克魯維酵母菌（Kluyveromyces marxianus）。其余所有分離菌株與之對應的標準菌株的同源性均在99%及以上，表明其具有較近的親緣性。菌株4-2、4-5、7-1、9-3、9-4、9-6鑒定為戴爾有孢圓酵母（Torulaspora delbrueckii）；菌株10-3鑒定為乳酸克魯維酵母（Kluyveromyces lactis）；菌株10-6鑒定為發酵畢赤酵母（Pichia fermentans）；菌株1-1、2-1、3-5、5-3、6-2、8-1鑒定為庫德畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）。

JAKOBSEN M等［10］發現奶酪中漢遜德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、溶磷白地霉（Galactomyces geothricum）和解脂耶羅維亞酵母（Yarrowia lipolytica）是最主要的酵母種屬；LOPANDIC K等［11］研究表明，新鮮奶酪中常分離出涎沫假絲酵母菌（Candida zeylanoides）、馬克斯克魯維酵母菌（Kluyveromyces marxianus）、解脂耶羅維亞酵母（Yarrowia lipolytica）；MOGENS J等［12］認為通常干酪中的酵母主要有白地霉（Geotrichum candidum）、漢遜德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）、乳酸克魯維酵母（Kluyveromyces lactis）、鏈形念珠菌（Candida catenulate）、解脂耶羅維亞酵母（Yarrowia lipolytica）；馬春燕等［13］對新疆哈薩克族傳統手工發酵制作的乳酪中所含發酵菌的種類進行鑒定，結果表明其中的主要酵母菌為單孢釀酒酵母（Saccharomyces unisporus）和東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）；李宇輝等［14］從新疆伊犁牧區采集奶酪樣品20份，經鑒定主要的酵母菌為發酵畢赤酵母（Pichia fermentans）和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。由此來看，本研究分離得到的酵母菌有其獨特的發酵菌種類，可能與其傳統的制作方法，當地的環境、氣候、發酵溫度［15］等因素有關。但從目前許多對發酵乳制品中酵母菌的研究來看，尚未發現對傳統乳制品中庫德畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）的詳盡報道。

3　結論

本研究對新疆塔城地區哈薩克族傳統奶酪中的酵母菌進行分離鑒定，從采集的10份樣品中分離純化得到44株酵母菌，通過形態學觀察、生理生化試驗和對5.8S rDNA序列進行PCR擴增相結合的方法進行鑒定。鑒定結果表明，44株酵母菌中有6株為戴爾有孢圓酵母（T.delbrueckii）；2株為乳酸克魯維酵母（K.lactis）；1株為發酵畢赤酵母（P. fermentans）；1株為馬克思克魯維酵母（K.marxianus）；剩余34株均為庫德畢赤酵母（P.kudriavzevii）。

全面系統地了解塔城牧區奶酪中酵母菌的構成，并對其中性能優良的酵母菌菌種進行收集和保存，使這一寶貴的資源得到保護，避免酵母菌資源的丟失，深入地研究和認識酵母菌資源，這對我國酵母菌資源的保護、開發和利用有著重要意義。

［1］倪慧娟.新疆地區和青海地區傳統發酵乳制品中酵母菌的生物多樣性［D］.呼和浩特：內蒙古農業大學，2009.

［2］董曉婉.新疆和布克賽爾縣哈薩克族和蒙古族傳統乳制品中乳酸菌菌群多樣性的研究［D］.石河子：石河子大學，2014.

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Isolation and identification of yeast from traditional cheese of Kazak in Tacheng region of Xinjiang

LU Wenjuan，LI Baokun*，LU Shiling
（College of Food Science，Shihezi University，Shihezi 832000，China）

In order to protect superior yeast strains from traditional cheese of Kazak in Tacheng region of Xinjiang，44 yeast strains were isolated from 10 samples of traditional cheese.The isolated strains were identified by colonial morphology，physiological and biochemical characteristics identification and 5.8S rDNA sequence homology analysis.Five species were identified，including 34 strains ofPichia kudriavzevii，six strains ofTorulaspora delbrueckii，two strains ofKluyveromyces lactis，one strain ofKluyveromyces marxianusand one strain ofPichia fermentans.Results showed that the yeasts in traditional cheese of Kazak were different with that in other regions，and had its unique resources.

cheese；yeast；isolation and identification

TS201.3

0254-5071（2016）07-0024-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.07.006

2016-03-07

國家自然基金地區項目（31460007）

蘆文娟（1991-），女，碩士研究生，研究方向為乳制品微生物。

李寶坤（1979-），男，副教授，博士，研究方向為乳制品微生物。