HS-SPME結合GC-MS法建立金沙窖酒指紋圖譜

馬龍利，張情亞，余德順，邱樹毅，鄒江鵬，王長存，于　海

HS-SPME結合GC-MS法建立金沙窖酒指紋圖譜

馬龍利1，2，張情亞1，2，余德順1，2*，邱樹毅3，鄒江鵬4，王長存4，于海1，2

（1.貴州大學化學與化工學院，貴州 貴陽 550025；2.中國科學院地球化學研究所環境地球化學國家重點實驗室超臨界流體中心，貴州 貴陽 550081；3.貴州省發酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州 貴陽 550025；4.貴州金沙窖酒酒業有限公司，貴州 金沙 551800）

采用頂空-固相微萃取（HS-SPME）對金沙窖酒中的風味物質進行提取，氣相色譜-質譜聯用（GC-MS）技術對其進行分析，以26個共有峰作為金沙窖酒特征指紋峰，建立了金沙窖酒指紋圖譜的研究方法，并采用夾角余弦法評價了包括金沙窖酒在內的20種白酒與對照指紋圖譜間的相似度。結果表明，金沙窖酒與對照指紋圖譜間的相似度均＞99%，其他品牌白酒與對照指紋圖譜間的相似度均＜92%，表明所建立的指紋圖譜能夠用于鑒別金沙窖酒，指紋圖譜相似度＞99%可以鑒定為金沙窖酒。

頂空固相微萃取；氣相色譜-質譜聯用；指紋圖譜；金沙窖酒

白酒是我國的傳統飲料，歷史悠久，與朗姆酒、伏特加、白蘭地、金酒、威士忌并稱為世界六大蒸餾酒［1］，目前已經形成了以濃香型、醬香型、清香型、米香型四大香型為主的十二種香型［2］，除去白酒中98%～99%的乙醇和水以外，通常把剩余的1%～2%的物質稱為微量成分，但正是這些含量極少的微量成分決定了白酒獨特的風味，也是決定不同品牌白酒及其口味別具特色的一個重要因素［3］。因成分復雜，主體香的成分不易確定，一直以來對醬香型白酒質量的把控還主要依賴于評酒師的感官評價，無法利用客觀的數據來進行質量控制，因此，白酒市場屢屢爆出高端白酒假酒的丑聞，嚴重擾亂了市場秩序并損害了消費者的權利。

隨著分析儀器的不斷發展，越來越多的分析技術被應用于白酒成分的檢測中，如近紅外光譜（near infrared spec trum，NIR）、氣相色譜（gas chromatography，GC）、氣相色譜-質譜聯用（gaschromatography-massspectrography，GC-MS）、氣相色譜-嗅聞（gas chromatography-olfactometry，GC-O）、電子鼻（electronic nose，e-nose）等技術，運用這些分析技術對白酒中微量成分進行定性、定量分析，并取得了一系列的成效［4-7］，指紋這一概念最早來源于法醫學，可以根據每個人指紋結構上的細微不同來鑒定不同的人［8］。指紋譜圖技術主要應用在中藥領域，中藥指紋圖譜技術是指利用光譜或色譜等檢測方法獲得中藥材組分的圖譜，經數據處理后，對圖譜進行“過濾”以及簡化，從而獲得穩定、專屬的特征指紋圖譜數據，為藥材質量控制以及打假提供依據［9］，基于指紋譜圖技術在中藥材質量控制以及真假鑒別方面的廣泛應用［10-13］，近年來，對于酒類指紋圖譜技術的研究也日益流行起來。孫其然等［14］應用GC-MS技術建立了貴州茅臺酒的指紋圖譜，并確定了其中的35種組分作為茅臺酒的共有特征組分，結果表明，利用指紋圖譜相似度能將茅臺酒與其他品牌白酒區分開來。朱潘煒等［15］利用GC-MS技術建立了不同年份的成品黃酒的指紋圖譜，結果表明，不同批次的黃酒相似度較好（＞99%），能夠用于成品黃酒的鑒別與質量評價。

本研究以金沙窖酒為主要研究對象，采用頂空固相微萃取（headspace solid-phase microextraction，HS-SPME）［16］結合GC-MS的方法建立金沙窖酒的特征指紋圖譜，通過對金沙窖酒與其他品牌白酒指紋圖譜相似度的比較并結合聚類分析進行直觀分類，初步探討利用所建立的指紋圖譜能否用于金沙窖酒的鑒別，以期為金沙窖酒的質量控制以及鑒別提供依據。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

叔戊醇（純度≥99.5%）、乙酸正戊酯（純度≥99.5%）、2-乙基丁酸（純度≥99.5%）：阿拉丁試劑有限公司；無水乙醇（純度≥99.8%）：天津科密歐化學試劑有限公司；以上試劑均為色譜純。

金沙窖酒（8個批次）：貴州金沙窖酒酒業有限公司，分別命名為：JS1、JS2、JS3、JS4、JS5、JS6、JS7、JS8；其他12個品牌各1種白酒，分別命名為：MT（醬香型）、WZ（醬香型）、YX（醬香型）、QJ（醬香型）、GT（醬香型）、TCSP（醬香型）、LJ（醬香型）、117J（醬香型）、WLY（濃香型）、FG（濃香型）、HX（清香型）、SH（米香型）：市售。

1.2儀器與設備

7890A GC、5975C GC-MS聯用儀：美國Agilent公司；DVB/CAR/PDMS（二乙烯基苯/羧基/聚二甲基硅氧烷）（50/30 μm）萃取頭、手動進樣手柄、SPME攪拌加熱平臺：美國Supelco公司；Cp-wax 57 CB毛細管柱（50 m×0.25 mm× 0.20 μm）：美國Warian公司。

1.3方法

1.3.1內標混合液及樣品的制備

內標混合液的配制：用移液槍準確吸取叔戊醇、乙酸正戊酯、2-乙基丁酸各2 mL于100 mL容量瓶中，用體積分數為60%的乙醇溶液定容至100 mL，配制成2%的內標混合液，低溫、密封、避光保存。

待測酒樣的制備：取10 mL白酒酒樣，加入0.2 mL 2%內標混合液，充分混勻，低溫、密封、避光保存。

1.3.2樣品前處理

取待測酒樣2 mL于5 mL的萃取瓶中，放入磁力攪拌轉子，旋緊瓶蓋。將萃取瓶放在固相微萃取攪拌加熱平臺上，設置溫度為35℃，預熱15 min，萃取頭在使用前插入250℃ GC進樣口解吸5 min，隨后插入萃取頭距液面1～2 mm，萃取30min，取出萃取頭后立即插入GC進樣口，熱解吸5min。

1.3.3 GC-MS條件

色譜條件：Cp-wax 57 CB毛細管柱色譜柱（50 m× 0.25 mm×0.20 μm）；進樣口溫度250℃；載氣高純氦氣（99.999 9%）；流速0.8 mL/min；分流進樣，分流比30∶1；程序升溫為柱溫起始溫度35℃，保持5 min，先以5℃/min升溫至100℃，保持2 min，再以10℃/min升溫至160℃，保持15 min；進樣量：0.6 μL。

質譜條件：電離方式為電子電離（electronic ionization，EI），電子能量70 eV，離子源溫度230℃，接口溫度280℃，全掃描方式，掃描質量范圍：30～500 amu。

1.3.4定性定量分析方法

定性方法：通過對GC-MS總離子流色譜圖與美國國家標準技術研究所（nationalinstituteofstandardsandtechnology，NIST）11質譜庫中的化合物進行比對（匹配度＞80%），同時通過GC分析所得色譜圖與標準品的色譜圖保留時間進行比對，在相同色譜條件下，以相同保留時間為同一種物質為依據對色譜峰進行定性分析。

定量方法：采用三內標定量法，選擇3個內標物作為參照峰，計算各色譜峰的相對保留時間（α值，共有峰的保留時間與參照峰保留時間的比值）以及相對峰面積（Sr值，共有峰的峰面積與參照峰峰面積的比值），叔戊醇用于醇類物質分析、乙酸正戊酯用于酯類、醛酮類物質分析、2-乙基丁酸用于乙酸后面高沸點組分分析，3個內標物的相對保留時間以及相對峰面積均為1。

1.3.5數據分析

采用Aglient Chemstation工作站、中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統A版（2004 A版，國家藥典委員會）、SPSS 21.0軟件、EXCEL軟件對數據進行處理。

2　結果與分析

2.1方法學考察

2.1.1儀器精密度考察

取同一批次金沙窯酒酒樣，按照上述1.3.1方法添加內標混合液，經HS-SPME萃取后，采用1.3.3方法中GC-MS條件連續進樣5次，對共有峰的相對保留時間（α值）以及相對峰面積（Sr值）進行考察。以叔戊醇、乙酸正戊酯、2-乙基丁酸三個內標峰作為參照峰，計算出共有峰的相對保留時間α值和相對峰面積Sr值。結果表明，所有共有峰的α值的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）＜0.05%，各共有峰相對峰面積Sr值的RSD＜5%，表明儀器的精密度良好。

2.1.2方法重現性考察

取同一批次白酒5份，分別按照1.3.1方法添加內標混合液，經HS-SPME萃取后，采用1.3.3方法中GC-MS條件進樣分析，對共有峰的α值以及Sr值進行考察。結果表明，各共有峰α值的RSD＜0.05%，共有峰Sr值的RSD＜5%。表明該方法具有較好的重現性。

2.1.3樣品穩定性考察

取同一批次白酒1份，按照1.3.1方法添加內標混合液，12 h后經HS-SPME萃取后，采用1.3.3方法中GC-MS條件每隔3 h進樣一次，檢測點為0、3 h、6 h、9 h、12 h，共進樣5次，對共有峰的α值以及相對峰面積Sr值進行考察。結果表明，各共有峰α值的RSD＜0.05%，共有峰Sr值的RSD＜5%，表明樣品在24 h內穩定性良好。

2.2金沙窖酒指紋圖譜的建立

取金沙窖酒酒樣：JS1、JS2、JS3、JS4、JS5、JS6各1.5 mL，在1.3.2和1.3.3試驗條件下進行GC-MS分析，共鑒定出金沙窖酒中60種風味物質（包含3種內標物），其中，確定26個共有峰，并以此作為金沙窖酒的特征指紋峰，繪制金沙窖酒特征峰的GC-MS指紋圖譜，結果見圖1。共有峰的峰面積之和占總出峰面積的90%以上，符合指紋圖譜建設的技術要求。

圖1　金沙窖酒特征峰的GC-MS指紋圖譜Fig.1 GC-MS fingerprint of the characteristic peaks of JinshaBaijiu

2.3相似度分析

以6個批次金沙窖酒中26個特征峰的Sr值的均值為基本數據，參照文獻［13］采用夾角余弦法計算圖譜間的相似度，結果見表1。

表1　6批次金沙窖酒的指紋圖譜特征峰的相對保留時間與相對峰面積Table 1 Relative retention time and relative peak area of fingerprint characteristic peaks of six batches of JinshaBaijiu

由表1可知，6個批次金沙窖酒的指紋圖譜相似度很高，均＞99%，反映了金沙窖酒質量的穩定性。

采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統A版對金沙窖酒進行指紋圖譜分析，本實驗采用平均數法［17］對6個批次金沙窖酒指紋圖譜進行疊加，結果見圖2。

圖2　6個批次金沙窖酒指紋圖譜與對照指紋圖譜疊加圖Fig.2 Overlapped fingerprints of six batches of JinshaBaijiu and standard

由圖2可知，6個批次金沙窖酒的指紋圖譜具有很好的重疊性，每個批次金沙窖酒所含的色譜峰數量基本一致，采用平均數法自動生成對照指紋圖譜，其能很好的體現金沙窖酒的特征，可以作為金沙窖酒代表指紋圖譜。

2.4指紋圖譜用于白酒的鑒別

按照上述分析方法，分別對JS7、JS8、MT、WZ、YX、QJ、GT、TCSP、LJ、117J、WLY、FG、HX、SH進行GC-MS分析，按照夾角余弦法分別計算出各酒樣與金沙窖酒對照指紋圖譜間的相似度，結果見表2，以所有特征峰的相對峰面積Sr為變量，將所有酒樣進行系統聚類分析，選擇組間連接法作為分類方法，夾角余弦作為區間度量標準，聚類結果樹狀圖如圖3所示。

表2　不同酒樣與金沙窖酒對照指紋圖譜間的相似度計算結果Table 2 Calculation results of similarity of fingerprints between differentBaijiusamples and Jinsha standard

由表2可知，JS7、JS8作為金沙窖酒與金沙窖酒對照指紋圖譜之間的相似度很高，均＞99%；而117J與金沙窖酒對照指紋圖譜間相似度較高，達到了97.57%，其他品牌白酒指紋圖譜與金沙窖酒對照指紋圖譜之間的相似度均＜92%，尤其是濃香型白酒WLY、FG，清香型白酒HX以及米香型白酒SH與金沙窖酒指紋圖譜間相似度均＜60%，也驗證了醬香型白酒與濃香型白酒的風味物質具有很大的差異。從聚類分析結果的樹狀圖（圖3）也能很直觀地看到，基于所選的共有峰作為金沙窖酒的特征指紋峰，能很好地將金沙窖酒與其他白酒區分開來，所有白酒被分為8類，8種金沙窖酒為一類，117J單獨成一類，MT、LJ分為一類，WZ、TCSP、YX、QJ被分為一類，GT單獨成類，清香型HX、米香型SH、濃香型WLY、FG分別單獨成類。聚類趨勢與相似度計算結果一致，兩種方法的結果得到了相互驗證。

圖3　不同酒樣聚類分析樹狀圖Fig.3 Dendrogram of differentBaijiusamples by clustering analysis

因此，利用指紋圖譜用于鑒別金沙窖酒是可行的，所選26個共有峰作為金沙窖酒特征指紋峰能很好地體現金沙窖酒的特征，并能很好地將金沙窖酒與其他白酒區分開來，指紋圖譜相似度＞99%，可以認為是金沙窖酒。

3　結論

本研究采用HS-SPME-GC-MS法對貴州金沙窖酒中揮發性物質進行了分析，并對所建立的方法進行了方法學考察，結果表明，儀器精密度、方法重現性和樣品穩定性均良好，為指紋圖譜的建立提供了穩定、可靠的數據。選取26個共有峰作為金沙窖酒的特征指紋峰，建立了金沙窖酒特征指紋圖譜，采用夾角余弦法對金沙窖酒指紋圖譜相似度進行了計算。結果表明，6個批次的金沙窖酒GC-MS指紋圖譜的相似度＞99%，最后利用所建立的金沙窖酒指紋圖譜對不同白酒進行鑒別，聚類分析結果與相似度分析一致，說明利用GC-MS指紋圖譜鑒別金沙窖酒是可行的，相似度＞99%可以認為是金沙窖酒，為金沙窖酒的質量控制以及鑒別提供了技術參考。

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Establishment of fingerprint of JinshaBaijiuby HS-SPME combined with GC-MS

MA Longli1，2，ZHANG Qingya1，2，YU Deshun1，2*，QIU Shuyi3，ZOU Jiangpeng4，WANG Changcun4，YU Hai1，2
（1.College of Chemistry and Chemical Engineering，Guizhou University，Guiyang 550025，China；2.Research Center of Supercritical Fluids，State Key Laboratory of Environment Geochemistry，Institute of Geochemistry，Chinese Academy of Sciences，Guiyang 550081，China；3.Province Key Laboratory of Fermentation Engineering and Biopharmaceutical，Guiyang 55025，China；4.Guizhou Jinsha Winery Co.，Ltd.，Jinsha 551800，China）

The flavor compounds in JinshaBaijiu（liquor）were extracted by headspace-solid phase micro extraction（HS-SPME）and analyzed by GC-MS.Using the 26 common peaks as the characteristic fingerprint peaks of JinshaBaijiu，and the research method of the fingerprint of JinshaBaijiuwas established.The similarity of the fingerprints of 20 samples including JinshaBaijiuand the control was evaluated by included angle cosine method.The results showed that the similarity of fingerprints was more than 99%between JinshaBaijiuand standard，and less than or equal to 92% between other brandsBaijiuand standard，which indicated that the established fingerprint could be used to distinguish JinshaBaijiu.The similarity of fingerprints was more than 99%between theBaijiuand standard，theBaijiucould be identified as JinshaBaijiu.

headspace-solid phase micro extraction；GC-MS；fingerprint；JinshaBaijiu

O657.6

0254-5071（2016）07-0050-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.07.011

2016-05-02

2013年度省市院科技合作項目（省市院合2013-1）

馬龍利（1990-），男，碩士研究生，研究方向為精細化工技術。

余德順（1963-），男，研究員，碩士，主要從事生物資源開發與精細化工研究工作。