坎皮納斯類芽孢桿菌木聚糖酶的純化以及酶學性質

陳　磊，趙祥穎，劉建軍，

坎皮納斯類芽孢桿菌木聚糖酶的純化以及酶學性質

陳磊1，趙祥穎2，劉建軍1，2*

（1.齊魯工業(yè)大學 生物工程學院，山東 濟南 250013；2.山東省食品發(fā)酵工程重點實驗室，山東 濟南 250013）

采用硫酸銨鹽析、Sephadex G-50凝膠過濾、DEAE Sepharose Fast Flow離子交換層析對坎皮納斯類芽孢桿菌（Paenibacillus campinasensis）xy-7發(fā)酵液進行分離純化，獲得純化的木聚糖酶，純化倍數(shù)為26.36，酶活回收率為5.13%。十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）結果為單一條帶，分子質量為24.5 ku。酶學性質研究結果表明，該酶的最適反應溫度為60℃，最適pH值為8.0。K+、Fe2+對酶有激活作用，Zn2+、Cu2+對酶有強烈的抑制作用。以櫸木木聚糖為底物時，米氏常數(shù)Km=4.733 mg/mL，最大酶反應速率Vm=315.85 μmol/（min·mg）。

坎皮納斯類芽孢桿菌；木聚糖酶；分離純化；酶學性質

木聚糖（xylan）是由β-1，4木糖苷鍵連接起來的多聚糖，分子中含有許多葡萄糖醛酸、乙酰基、阿拉伯糖、阿魏酸、香豆酸等側鏈基團［1］。它是半纖維素中最主要的成分，在農業(yè)上被當作廢料而大量浪費［2］。木聚糖酶是降解半纖維素木聚糖的一組酶的總稱［3］，包括切β-1，4-內切木聚糖酶、β-D-木糖苷酶、α-L-呋喃阿拉伯糖苷酶、α-D-葡萄糖醛酸苷酶、乙酰木聚糖酯酶和酚酸酯酶等［4］。在木聚糖降解酶系中，β-1，4-內切木聚糖酶是使木聚糖完全水解最關鍵的酶，主要來源于細菌、真菌、放線菌等微生物［5］。目前，木聚糖酶在食品行業(yè)中引人注目的應用是作為面包品質改良劑［6］。在造紙行業(yè)中，堿性木聚糖酶可以提高紙漿的漂白率，并因此減少化學漂白劑的用量［7］。大多數(shù)木聚糖酶的分離純化采用多步非特異性方法，如粗沉淀之后，采用離子交換、凝膠層析、疏水層析等［8］。目前，國內外對木聚糖酶的研究已有較多的報道，但對坎皮納斯類芽孢桿菌產木聚糖酶的分離純化以及酶學性質等方面的研究較少。本研究以一株坎皮納斯類芽孢桿菌為發(fā)酵菌株，利用鹽析、凝膠色譜分離技術和離子柱層析技術對該菌發(fā)酵產生的木聚糖酶進行分離純化及酶學性質研究，以期為工業(yè)生產提供理論指導。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌株

坎皮納斯類芽孢桿菌（Paenibacillus campinasensis）xy-7：山東省食品發(fā)酵工程重點實驗室保存。

1.1.2培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：木聚糖1%，酵母浸粉0.5%，蛋白胨1%，NaCl 0.5%，pH 8.0；121℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：木聚糖1%，蛋白胨0.5%，K2HPO40.05%，KCl 0.08%，MgSO40.08%，pH 8.0；121℃滅菌20 min。

1.1.3主要試劑

木聚糖（分析純）：美國Sigma公司；牛血清白蛋白（生化試劑）：南京奧多福尼生物科技有限公司；蛋白質分子質量標準品（生化試劑）：寶生物工程（大連）有限公司。

1.2儀器與設備

SephadexG-50層析柱（2.5cm×20cm）、DEAESepharose Fast Flow層析柱（2.5 cm×20 cm）：北京瑞達恒輝科技發(fā)展有限公司；ZN17-HD自動液相色譜分離層析儀：上海滬西分析儀器廠有限公司。

1.3實驗方法

1.3.1木聚糖酶活力測定

取0.1 mL適當稀釋的酶液，加入到1.9 mL用Tris-HCl緩沖液（pH8.0）配制的1%木聚糖溶液中，60℃反應10 min，3，5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）法測定還原糖（以木糖計）［9］。木聚糖酶活定義：在上述條件下，每分鐘水解木聚糖產生1 μmol還原糖（以木糖計）所需酶量定義為一個酶活力單位（IU/mL）。

木聚糖酶活、比酶活、酶回收率、純化倍數(shù)等計算公式，參照TSENG M J等［10］的方法。

1.3.2分析檢測［11-12］

蛋白質含量測定采用考馬斯亮藍法；木聚糖酶的純度測定采用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）法。

1.3.3木聚糖酶的分離

（1）粗酶液的制備

坎皮納斯類芽孢桿菌xy-7菌株在37℃、180 r/min、裝液量30 mL/250 mL條件下，培養(yǎng)24 h。所得發(fā)酵液離心（9 000 r/min、15 min）收集上清液，即為木糖酶粗酶液。

（2）硫酸銨分級沉淀［13］

取6支離心管，每支加入離心后粗酶液10 mL，分別加干燥研磨后的（NH4）2SO4至飽和度為0、20%、40%、60%、80%、100%。充分溶解后置于4℃環(huán)境中過夜，離心，測定沉淀中木聚糖酶活力及沉淀中蛋白質含量，確定最佳鹽析區(qū)間。將蛋白沉淀用磷酸鹽緩沖液（pH 6.5）復溶，離心（4℃、10 000 r/min、10 min）除去不溶沉淀。所得上清液用蒸餾水透析（截留分子質量為8 000～14 000 u），濃縮。

1.3.4木聚糖酶的純化

（1）Sephadex G-50層析柱凝膠過濾

將濃縮后的木聚糖酶液取5 mL上樣于經Tris-HCl緩沖液（pH8.0）平衡的SephadexG-50層析柱（3.0cm×20cm），并用同一種緩沖液以3.0 mL/min的流速洗脫。根據(jù)波長280 nm處吸光度值的變化開始收集樣品，每管6 mL，按照1.3.1方法檢測木聚糖酶活性。將有酶活的峰收集，并濃縮。

（2）DEAE Sepharose Fast Flow離子層析

將濃縮后的酶液取5 mL上樣于經Tris-HCl緩沖液（pH 8.0）平衡的DEAE Sepharose Fast Flow離子層析柱（2.5 cm×20 cm），并以2.5 mL/min流速，0～1 mol/L NaCl梯度洗脫。根據(jù)波長280 nm處吸光度值的變化開始收集樣品，每管6 mL，按照1.3.1方法檢測木聚糖酶活力。將有酶活的峰收集，濃縮。

所得的濃縮液取5 mL上樣于經Tris-HCl緩沖液（pH 9.0）平衡的DEAE Sepharose Fast Flow柱（2.5 cm×20 cm），并以2.5 mL/min流速，0～1 mol/L NaCl梯度洗脫。根據(jù)波長280 nm條件下吸光度值的變化開始收集樣品，每管6 mL，按照1.3.1方法檢測木聚糖酶活力。將有酶活的峰收集，濃縮。

1.3.5木聚糖酶的分子質量測定

采用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）法。遷移率計算公式、標準蛋白質分子質量的對數(shù)和遷移率的標準曲線、木聚糖酶分子質量計算，參照張蕾等［11］的方法。

1.3.6木聚糖酶的酶學性質

（1）木聚糖酶最適反應溫度

分別在50℃、55℃、60℃、65℃、70℃水浴條件下進行酶解反應并測定酶活力，以酶活力最高者為100%計算相對酶活力，重復3次，取平均值。

（2）木聚糖酶的最適pH

采用pH值為6.0、6.5、7.0的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）配制底物，pH 7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0的Tris-HCl緩沖液配制底物和稀釋酶液，在60℃條件下分別用不同pH值的木聚糖底物進行酶解，并按上述方法測定酶活力。以酶活力最高者為100%計算相對酶活力，重復3次，取平均值。

（3）金屬離子對酶活的影響

將金屬離子（Zn2+、Mg2+、Fe2+、Cu2+、Ca2+、Mn2+、K+）分別加入到木聚糖酶的反應體系中，使金屬離子終濃度為5 mmol/L，在60℃條件下按正常酶活體系測定酶活力。為了排除陰離子的影響，除了Ca2+、K+的陰離子為Cl-，其余為SO42-。以未處理酶液的酶活力為100%計算相對酶活力，重復3次，取平均值。

（4）木聚糖酶的米氏常數(shù)Km和最大反應速率Vm

根據(jù)Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法，測定底物濃度不同時酶的活力，然后計算出在不同濃度時的反應速率，取雙倒數(shù)得到回歸方程，求出木聚糖酶米氏常數(shù)Km和最大反應速率Vm。

（5）木聚糖酶的專一性

將1%的木聚糖、羧甲基纖維素、淀粉、蔗糖作為底物，在60℃條件下按正常酶活體系測定酶活力，以木聚糖底物的酶活力為100%計算相對酶活。

2　結果與分析

2.1木聚糖酶分離

在不同（NH4）2SO4飽和度條件下，硫酸銨分級鹽析結果見圖1。

圖1　木聚糖酶分段鹽析純度和回收率Fig.1 Purity and recovery rate of xylanase by fractional salting out

由圖1可知，當（NH4）2SO4飽和度＞80%時，沉淀中酶的比酶活和回收率很低，說明主要為雜蛋白。所以綜合比酶活和酶活回收率兩個因素考慮，本實驗選擇（NH4）2SO4飽和度60%為最適鹽析條件。

2.2木聚糖酶純化

SephadexG-50層析凝膠過濾、pH=8.0DEAESepharose Fast Flow離子交換層析、pH=9.0 DEAE Sepharose Fast Flow離子交換層析，洗脫曲線分別見圖2～圖4。

圖2　Sephadex G-50凝膠層析柱純化木聚糖酶洗脫曲線Fig.2 Elution curve of xylanase purified by Sephadex G-50 gel chromatography column

由圖2可知，經過SephadexG-50凝膠層析過濾分離出兩個蛋白峰，有酶活力的是第一個峰。Sephadex G-50凝膠過濾分離范圍為1.5～30ku，適用于小分子蛋白分離、脫鹽。由圖3可知，經過pH=8.0 DEAE Sepharose Fast Flow離子交換層析分離出3個峰，其中有兩個峰有酶活，第一個峰有較高酶活，第二個峰酶活較低不具備研究價值。由圖4可知，經過pH=9.0 DEAE Sepharose Fast Flow離子交換層析分離出3個峰，第二個峰有酶活。

圖3　DEAE Sepharose Fast Flow離子交換層析柱純化木聚糖酶洗脫曲線（pH=8.0）Fig.3 Elution curve of xylanase purified by DEAE Sepharose Fast Flow ion-exchanged chromatography column（pH=8.0）

圖4　DEAE Sepharose Fast Flow離子交換層析柱純化木聚糖酶洗脫曲線Fig.4 Elution curve of xylanase purified by DEAE Sepharose Fast Flow ion-exchanged chromatography column（pH=9.0）

木聚糖酶純化倍數(shù)和比酶活見表1。根據(jù)鄒永龍等［14］的研究表明，具有木聚糖降解酶活性的各個組分如內切木聚糖酶、木聚糖苷酶等參與木聚糖降解為木糖單體同時存在時，它們之間的協(xié)同作用可能使實驗過程中測得的酶活力值高于實際值，致使酶活力的回收率偏低，這在酶分離純化的初期表現(xiàn)得很明顯。

表1　木聚糖酶純化結果Table 1 Purification results of xylanase

由表1可知，經過鹽析、G-50凝膠過濾、兩次離子交換層析后，純化倍數(shù)是26.36，酶活回收率為5.13%，比酶活提高至4 631.3 IU/mg。雖然在實驗中也檢測到其他具有木聚糖水解活性的組分，但由于酶活較低，不具備研究意義，所以只是鑒定了其中的一個具有較高活性的組分，致使酶活力的回收率比較低。

木聚糖酶SDS-PAGE電泳結果見圖5。由圖5可知，1號泳道說明鹽析后的酶液中含有大量雜蛋白；2號泳道說明Sephadex G-50凝膠層析過濾后的酶液也含有大量雜蛋白；3號泳道說明經過pH 8.0離子層析后只含有3條蛋白帶，4號泳道說明經過pH 9.0離子層析后只含有1條蛋白帶。結果表明，純化后只有一條木聚糖酶電泳條帶，說明該酶為單肽鏈結構蛋白。按照1.3.5節(jié)方法計算出胞外木聚糖酶相對分子質量為24.5 ku。

圖5　木聚糖酶粗酶和純化后的電泳圖Fig.5 Electrophoretogram of crude and purified xylanase

2.2木聚糖酶的酶學性質

2.2.1木聚糖酶最適反應溫度

在不同溫度下測定木聚糖酶的酶活力，結果見圖6。從圖6可以看出，隨著溫度的增加，酶活呈上升趨勢，在溫度為60℃時達到最高峰，隨后開始下降，因此，最適溫度為60℃。在溫度為45～65℃時可保持80%以上的相對酶活，說明該酶具有很好的耐熱性，具有工業(yè)化潛力。例如，在面包制作方面，使用中溫木聚糖酶能使面包體積最大增加量為30%，而耐熱木聚糖酶可使面包增大40%～60%［16］。

圖6　木聚糖酶最適反應溫度Fig.6 Optimal reaction temperature of xylanase

2.2.2木聚糖酶的最適pH

在不同pH值下測定木聚糖酶的酶活力，結果見圖7。從圖7可以看出，隨著pH的增加，酶活呈上升趨勢，在pH值為8.0時達到最高峰，隨后開始下降；在pH值為6.5～8.5可保持85%以上的相對酶活；當pH＜6.5或＞8.5時相對酶活急劇下降。pH值為10.0時，相對酶活為22.5%。因此，木聚糖酶的最適pH值為8.0。根據(jù)孫振濤等［15］的研究，粗酶液的最適pH值在7.0左右，這是由于粗酶液含有多種降解木聚糖的酶，如內切木聚糖酶、木聚糖苷酶等，這些酶影響最適pH的測定。

圖7　木聚糖酶最適pH值Fig.7 Optimal pH of xylanase

2.2.3金屬離子對酶活的影響

表2　不同金屬離子對木聚糖酶活性的影響Table 2 Effects of different metal ions on xylanase activity

由表2可知，K+、Fe2+對木聚糖酶有明顯激活作用。Zn2+、Cu2+對木聚糖酶有強烈的抑制作用，Ca2+、Mg2+、Mn2+使木聚糖酶活性有不同程度下降。

2.2.4木聚糖酶的米氏常數(shù)Km和最大反應速率Vm

圖8　木聚糖酶的米氏常數(shù)雙倒數(shù)曲線Fig.8 Lineweaver-Burk plot of Kmof xylanase

據(jù)Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法得出1/V（y）與1/［S］（x）呈線性關系，結果見圖8。直線方程為y=163.1x+34.46（相關系數(shù)R2=0.998），從而得出米氏常數(shù)Km=4.733 mg/mL，最大酶反應速率Vm=315.85 μmol/（min·mg）。

2.2.5底物專一性

由表3可知，該木聚糖酶對羧甲基纖維素、淀粉、蔗糖均沒有酶活力，具有良好的專一性，在生物漂白方面有很大潛力［17］。

表3　木聚糖酶的底物專一性Table 3 Substrate specificity of xylanase

3　結論

本實驗采用硫酸銨沉淀法、Sephadex G-50凝膠層析柱過濾、DEAE Sepharose Fast Flow離子交換層析純化出較高純度的木聚糖酶，純化倍數(shù)為26.36，酶活回收率為5.13%，分子質量為24.5 ku。酶學性質研究結果表明，該酶的最適反應溫度為60℃，最適pH值為8.0。該酶具有很好的耐堿性和耐熱性，以及底物專一性。

［1］劉瑞田，曲音波.木聚糖酶生物學特性及其誘導產生的研究進展［J］.工業(yè)微生物，1998，28（3）：38-42.

［2］DA S L，CARMONA E C.Production and characterization of cellulase-free xylanase fromTrichoderma inhamatum［J］.Appl Biochem Biotechnol，2008，150（2）：117-125.

［3］蔡少麗，楊章萍，黃建忠.里氏木霉制備木聚糖酶的產酶歷程［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2013，39（8）：113-118.

［4］馮波，尹翌，易旭東，等.康氏木霉固體發(fā)酵木聚糖酶條件的研究［J］.中國釀造，2015，34（10）：73-77.

［5］徐君飛，張居作.微生物β-l，4-內切木聚糖酶研究進展［J］.中國釀造，2014，33（5）：15-17.

［6］孫超，陳衛(wèi)平.微生物木聚糖酶及其應用研究進展［J］.中國釀造，2013，32（4）：24-29.

［7］李宗任，陳小泉.紙漿生物漂白技術［J］.黑龍江造紙，2008，36（3）：30-32.

［8］孫雷，朱孝霖，李環(huán)，等.木聚糖酶分離純化技術［J］.生物技術通報，2005，14（5）：51-54.

［9］MILLER G L.Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar［J］.Anal Chem，1959，31（3）：426-428.

［10］TSENG M J，YAP M N，RATANAKHANOKCHAI K，et al.Purification and characterization of two cellulase free xylanases from an alkaliphilicBacillus firmus［J］.Enzyme Microb Technol，2002，30（5）：590-595.

［11］張蕾，劉昱，蔣達和，等.生物化學實驗指導［M］.武漢：武漢大學出版社，2011：99-106.

［12］汪家政，范明.蛋白質技術手冊［M］.北京：科學出版社，2000：77-100.

［13］付燕秋，王欣宏，管斌，等.利用（NH4）2SO4分步鹽析法從麥芽中初步分離極限糊精酶［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2013，39（1）：119-202.

［14］鄒永龍，桑月蟬，彭建新，等.β-內切木聚糖酶的分離純化及其性質［J］.植物學報，1999，41（11）：1212-1216.

［15］孫振濤，劉建軍，趙祥穎，等.一株產木聚糖酶菌株的分離、鑒定及其酶學特性研究［J］.生物技術，2007，17（4）：74-77.

［16］江正強.微生物木聚糖酶的生產及其在食品工業(yè)中應用的研究進展［J］.中國食品學報，2005，5（1）：1-9.

［17］毛連山，余世袁.木聚糖酶在紙漿漂白中應用的研究現(xiàn)狀［J］.中國造紙學報，2006，21（3）：93-98.

Purification and enzymatic properties of xylanase fromPaenibacillus campinasensis

CHEN Lei1，ZHAO Xiangying2，LIU Jianjun1，2*
（1.College of Bioengineering，Qilu University of Technology，Jinan 250013，China；2.Food&Fermentation Engineering Key Lab of Shandong Province，Jinan 250013，China）

The fermentation liquid ofPaenibacillus campinasensisxy-7 was separated and purified by ammonium sulfate salting-out，Sephadex G-50 gel filtration and DEAE Sepharose Fast Flow ion-exchange column chromatography.The purified xylanase was obtained，the purification multiple was 26.36 and recovery rate of the enzyme was 5.13%.The electrophoresis result of SDS-PAGE was single band and mass of molecule was 24.5 ku.The results of enzymatic property showed that the optimal reaction temperature of xylanase was 60℃and the optimal pH was 8.0.The enzyme could be activated by Fe2+and K+，but inhibited by Zn2+and Cu2+.With beech xylan as substrate，the Kmwas 4.733 mg/ml and the Vmwas 315.85 μmol/（min·mg）.

Paenibacillus campinasensis；xylanase；separation and purification；enzymatic properties

Q814.1

0254-5071（2016）07-0064-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.07.014

2016-02-23

山東省自主創(chuàng)新專項（201422cx02602）

陳磊（1990-），男，碩士研究生，研究方向為生化反應工程。

劉建軍（1962-），男，研究員，博士，研究方向為微生物資源開發(fā)利用。