納豆激酶NKII分離純化及其酶促動力學(xué)研究

李　睿，阮文輝

納豆激酶NKII分離純化及其酶促動力學(xué)研究

李睿1，阮文輝2*

（1.山西中醫(yī)學(xué)院，山西 太原 030024；2.山西省醫(yī)藥與生命科學(xué)研究院，山西 太原 030006））

該實(shí)驗(yàn)主要采用疏水柱層析分離純化納豆激酶NKII，聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）結(jié)果為單一蛋白條帶，分子量為28 ku，酶活回收率56.51%，純化倍數(shù)17.90，比活力達(dá)48 407.77 IU/mg。采用纖維蛋白平板法及顯色底物法測定酶活力，結(jié)果表明，兩種方法相關(guān)性高。以S-2251為底物的動力學(xué)研究表明，米氏常數(shù)Km值為0.379 6 mmol/L，最大反應(yīng)速度Vm值為0.059 8 mmol/（L·min），Ca2+、Mg2+對酶活穩(wěn)定性效果明顯。

納豆激酶；分離純化；酶學(xué)性質(zhì)

隨著人們生活節(jié)奏的加快、飲食結(jié)構(gòu)的改變等，全球血栓栓塞性疾病的臨床發(fā)病率越來越高，心梗、脈管栓塞［1］等均為其引起的常見突發(fā)疾病，危害嚴(yán)重，發(fā)病年齡年輕化，給生活質(zhì)量帶來極大影響［2］。針對此現(xiàn)狀，近年來溶栓治療和預(yù)防類的保健食品及藥物的研發(fā)進(jìn)展迅速［3-5］。納豆激酶（nattokinase，NK）最初源自日本傳統(tǒng)的健康發(fā)酵食品—納豆，由納豆枯草芽孢桿菌表達(dá)，屬絲氨酸蛋白酶，具有很強(qiáng)的溶栓活性。對其的研究多集中在菌種選育、表達(dá)優(yōu)化、溶栓機(jī)理［6］、活性測定方法、純化方法、基因的克隆與表達(dá)［7］等方面。NK溶栓途徑有直接降解纖維蛋白、激活尿激酶與組織型纖溶酶原激活劑等，溶栓效果好，易提取、成本低、半衰期長、特異性強(qiáng)、不引起系統(tǒng)性纖溶、食源性安全無毒副作用、易吸收、可口服，具有很好的開發(fā)潛力。

本研究對象為篩選所得納豆枯草芽孢桿菌，產(chǎn)酶量大、活性高，具有極高工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。目前纖溶活性產(chǎn)品存在活性低、單療程所需注射劑量大的缺點(diǎn)［8-10］，并且純化過程復(fù)雜，活性檢測方法繁瑣。本研究希望建立純化納豆激酶的便捷方法，并深入探究所得NKII的活性檢測方法和酶促反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

納豆枯草芽孢桿菌：本實(shí)驗(yàn)室保藏。對硝基苯胺（pnitroaniline，pNA）：中國醫(yī)藥上海化學(xué)試劑公司；合成發(fā)色底物S-2251（H-D-Val-Leu-Lys-pNA·2HCl）：意大利Chromogenix公司；牛纖維蛋白原、尿激酶（1240 IU/mL）、凝血酶（150 BP）：中國藥品生物制品檢定所；苯基-瓊脂糖凝膠（PhenylSepharoseCl-4B）：美國AmershamBiosicences公司。

1.2儀器與設(shè)備

AKTA prime 100蛋白質(zhì)快速純化系統(tǒng)：Amersham Biosicences公司；8500型紫外分光光度儀：上海天美科技有限公司；Multiskan Ascent Thermo Labsystems酶標(biāo)儀：Thermo公司；J2-HC離心機(jī)：美國Beckman公司；905-ULTS超低溫冰箱：美國Forma Scientific公司。

1.3方法

1.3.1納豆激酶NKII粗酶液制備

納豆枯草芽孢桿菌經(jīng)種子培養(yǎng)，30℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)18 h；搖瓶發(fā)酵30℃、50 r/min振蕩培養(yǎng)72 h，離心取上清液制備NKII粗酶液。

1.3.2分級鹽析

NKII粗酶液中加入硫酸銨至不同飽和度，4℃靜置12 h后離心，分別檢測上清液及沉淀中酶活力。

1.3.3疏水層析

采用Phenyl Sepharose疏水柱層析分離純化NKII。上樣緩沖液為NaCl濃度1.5 mol/L的磷酸緩沖液（pH 7.4），階段洗脫NaCl濃度依次為0.9 mol/L、0.3 mol/L、0，洗脫速度2.0 mL/min，檢測并收集吸收峰。

1.3.4 SDS-PAGE電泳［11］

分離膠濃度12%，濃縮膠濃度5%。

1.3.5顯色底物法與纖維蛋白平板法的相關(guān)性

配制不同濃度NKII溶液，分別用纖維蛋白平板法、顯色底物法檢測其活性，以纖維蛋白平板法測得結(jié)果為橫坐標(biāo)，顯色底物法檢測得結(jié)果為縱坐標(biāo)作圖，考察其相關(guān)性。

1.3.6酶反應(yīng)速率曲線

酶促反應(yīng)過程中，每隔1 min檢測一次A405nm，至其基本恒定為止，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算產(chǎn)物pNA的濃度。以反應(yīng)時間為橫坐標(biāo)，產(chǎn)物濃度為縱坐標(biāo)，繪制速率曲線。

1.3.7 NKII的Km與Vm的測定

37℃條件下，酶作用于不同濃度底物S-2251溶液8 min后，分別測其A405nm，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線找到對應(yīng)產(chǎn)物pNA的濃度C，并換算為反應(yīng)速率作圖，反應(yīng)速率［mmol/（L·min）］= pNA濃度C（mmol/L）/反應(yīng)時間8（min）。

以底物S-2251濃度為橫坐標(biāo)，酶反應(yīng)速率V作為縱坐標(biāo)，作圖繪制米氏曲線。據(jù)Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法作圖［14］，根據(jù)改寫的米氏方程：由直線的斜率和截距，計(jì)算出該溫度下的表觀動力學(xué)參數(shù)Vm和Km值。

1.3.8測定方法

蛋白質(zhì)含量的測定：考馬斯亮藍(lán)法，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品［12］。繪制蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算樣品中蛋白質(zhì)含量。

酶活力測定：纖維蛋白平板法參照ASTRUP T等［13］的方法，以纖維蛋白溶解圈面積表示NKII活性。取10 μL溶液點(diǎn)樣于纖維蛋白平板，37℃、18 h后測溶圈面積，以尿激酶為標(biāo)準(zhǔn)品，以尿激酶標(biāo)準(zhǔn)品的溶圈面積對應(yīng)酶活為1 IU/mL。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算樣品中NKII活性。

顯色底物檢測法：取50 μL S-2251底物溶液，37℃預(yù)熱5 min，加入預(yù)熱2 min的酶液50 μL迅速振蕩，37℃、8 min后，酶標(biāo)儀檢測其光吸收值A(chǔ)405nm。pNA標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=3.901 1X-0.000 3，相關(guān)系數(shù)0.999 1。

在37℃、pH值7.4的條件下，每分鐘催化水解產(chǎn)生1 μmol的pNA的酶活力定義為1U。其計(jì)算公式為：

酶活U（μmol·min-1·L-1）=

2　結(jié)果與分析

2.1尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線

尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

由圖1可知，當(dāng)酶濃度為0～200.0 IU/mL時，酶活力單位與溶圈面積線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.994 7。

2.2分級鹽析

圖2　NKII分級鹽析曲線Fig.2 Salt-outing curve of NKII

由圖2可知，隨著硫酸銨飽和度的增加，NKII在上清液中逐步減少，沉淀中逐漸增加。30%飽和度之前，90%以上的酶活都在上清中，超過70%飽和度時，90%的酶活都集中在沉淀。故采用30%飽和度硫酸銨沉淀除去雜蛋白，再用70%飽和度硫酸銨沉淀NKII。

2.3 Phenyl Sepharose疏水柱層析

圖3　疏水層析洗脫曲線Fig.3 Elution curve of hydrophobic chromatography

圖4　洗脫峰纖維蛋白平板溶圈Fig.4 Dissolved area of eluting peak

由圖3、圖4可知，層析過程中有3個洗脫峰，僅第1洗脫峰（1～4管）收集液，可以明顯檢測到酶活，其余峰收集液均未測得酶活。蛋白檢測表明第1洗脫峰蛋白含量最高。

2.4 SDS-PAGE電泳純度鑒定

圖5　SDS-PAGE測定NKII分子質(zhì)量Fig.5 Molecular mass of NKII by SDS-PAGE

由圖5可知，疏水層析后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙酰胺凝膠電脈（sodiumdodecylsulfate-polypropyleneamidegel electrophoresis，SDS-PAGE）電泳，結(jié)果為單一蛋白譜帶，表明分離所得NKII達(dá)到電泳純。對比標(biāo)準(zhǔn)蛋白NKII的分子質(zhì)量為28 ku。

2.5 NKII純化方案評價(jià)

表1　各步純化結(jié)果Table 1 Results of different purification steps

由表1可知，通過硫酸銨分級鹽析和Phenyl Sepharose疏水柱層析后的樣品，酶活回收率56.51%，純化倍數(shù)17.90，比活力達(dá)48 407.77 IU/mg。該方案具有純化步驟簡單、纖溶活性高的明顯優(yōu)勢。

2.6顯色底物法與纖維蛋白平板法的相關(guān)性

纖維蛋白平板法能直觀地測得纖溶活性，但受時間、溫度、平板制作及點(diǎn)樣技術(shù)等實(shí)際操作影響較大；且該法不能定量檢測產(chǎn)物的生成，無法進(jìn)行反應(yīng)動力學(xué)研究。顯色底物法能彌補(bǔ)平板法的缺陷，靈敏、方便、準(zhǔn)確。NKII能水解連有pNA顯色基團(tuán)的小肽底物S-2251，可以進(jìn)行動力學(xué)研究。

圖6　顯色底物法與纖維蛋白平板法測定酶活相關(guān)性Fig.6 Enzyme activity correlation determination of fibrin plate and chromogenic substrate method

由圖6可知，兩種方法間相關(guān)性方程為：Y（顯色底物法）=0.0390X（纖維蛋白平板法）+0.6428，相關(guān)系數(shù)0.9901，具有較高相關(guān)性，因此可認(rèn)為顯色底物法檢測得的NKII活性可以表示其纖溶活性。

2.7 NKII反應(yīng)速率曲線

酶反應(yīng)速率V僅在最初一段時間內(nèi)保持恒定，隨反應(yīng)時間延長，V逐漸下降，原因有底物濃度降低，產(chǎn)物對酶的抑制、產(chǎn)物濃度增加加速了逆反應(yīng)等。研究酶反應(yīng)速率應(yīng)以酶反應(yīng)初速率V0為準(zhǔn)，此時各種干擾因素尚未起作用，速率保持恒定不變化［14］。

圖7　NKII酶反應(yīng)速率曲線Fig.7 Curve of NKII reaction velocity

由圖7可知，反應(yīng)進(jìn)行的前8 min之內(nèi)，產(chǎn)物pNA濃度與時間成正比增加，斜率恒定；之后pNA隨時間的增加變緩，30 min后，pNA濃度幾乎不再增加。因此測反應(yīng)初速率V0的最佳時間確定為8 min。

2.8 NKII的Km與Vm的測定

米氏曲線即反應(yīng)初速率V0與初始底物濃度［S］之間的關(guān)系。［S］對V0的影響較復(fù)雜，由圖8可知，［S］較低時，V0與［S］成正比，隨著［S］增加，V0不再成正比升高，表現(xiàn)為混合級；繼續(xù)增大［S］，V0幾乎保持不變，此時反應(yīng)體系中的酶被底物飽和［14］。

圖8　底物濃度對NKII反應(yīng)速率的影響Fig.8 Effect of substance concentration on reaction velocity of NKII

圖9　米氏常數(shù)雙倒數(shù)曲線Fig.9 Lineweaver-Burk cruve of Km

如圖9所示，1/［S］與1/V二者基本呈直線關(guān)系，方程為y=6.304 8x+16.721 5，相關(guān)系數(shù)R為0.997 6，符合米氏方程，據(jù)直線的斜率和截距計(jì)算出該溫度下的表觀動力學(xué)參數(shù)米氏常數(shù)Km為0.379 6 mmol/L，最大反應(yīng)速率Vm為0.0598mmol/（L·min）。

2.9金屬離子對NKII穩(wěn)定性的影響

常見金屬離子對NKII酶活力的影響如表2所示。

表2　金屬離子對NKII酶活性的影響Table 2 Effect of metallic ion on the enzyme activity of NKII

由表2可知，Ca2+、Mg2+對活性的穩(wěn)定性效果明顯，是較好的激活劑；Na+、K+無明顯影響；Zn2+、Co2+、Fe2+抑制作用較小，Mn2+、Cu2+有明顯抑制作用；Hg2+作為重金屬，對蛋白質(zhì)有變性作用，使NKII活性完全喪失。

3　結(jié)論

本研究以高產(chǎn)納豆枯草芽孢桿菌發(fā)酵液為原料，離心除菌體，硫酸銨分級鹽析，并僅通過一步Phenyl Sepharose疏水柱層析實(shí)現(xiàn)了NKII的分離純化［15-16］。酶收率56.51%，純化倍數(shù)17.90，比活力高達(dá)48 407.77 IU/mg；證實(shí)了顯色底物法與纖維蛋白平板法之間具有高相關(guān)性；動力學(xué)研究表明其米氏常數(shù)Km為0.379 6 mmol/L，最大反應(yīng)速率Vm為0.0598mmol/（L·min）。

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Separation，purification and enzymatic kinetics of nattokinase NKII

LI Rui1，RUAN Wenhui2*
（1.Shanxi University of Traditional Chinese Medicine，Taiyuan 030024，China；2.Shanxi Institute of Medicine and Life Science，Taiyuan 030006，China）

The nattokinase NKII was separated and purified by hydrophobic chromatography.The purified enzyme showed a single protein band in the SDS-PAGE and the molecular weight was 28 ku.The enzyme overall yield was 56.51%，the purification factor was 17.90 and the specific activity of NKII was 48 407.77 IU/mg.The activity of NK was detected by the methods of fibrin plate and chromogenic substrate method.Results proved that two methods had high correlation.When S-2251 was used as substance，the kinetic parameter Kmwas 0.379 6 mmol/L and Vmwas 0.059 8 mmol/（L·min），Ca2+and Mg2+showed significant effect on enzyme activity stability.

nattokinase；separation and purification；enzyme characteristic

Q819

0254-5071（2016）07-0089-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.07.019

2015-02-20

山西省科技攻關(guān)項(xiàng)目（20110321081-01，20120313016）；山西省經(jīng)信委基金項(xiàng)目（晉財(cái)2010-010））

李睿（1979-），女，講師，碩士，研究方向?yàn)樯锘ぁ⑹称贰⒈＝∑放c藥品研發(fā)。

阮文輝（1979-），男，工程師，博士，研究方向?yàn)樯锘ぁ⑹称贰⒈＝∑放c藥品研發(fā)。