青霉菌對剛毛藻纖維素降解的研究

梁寶東，魏海香，邊清鵬，姜淑喆

青霉菌對剛毛藻纖維素降解的研究

梁寶東1，魏海香1，邊清鵬1，姜淑喆2

（1.濟寧學院 生命科學與工程系，山東 曲阜 273155；2.山東大學 生命科學學院，山東 濟南 250013）

研究了青霉菌對剛毛藻中纖維素的降解條件。首先通過單因素試驗，研究了氮源種類、硫酸銨含量、料液比、pH、發酵溫度、發酵時間對纖維素降解的影響。選擇了pH值、料液比、硫酸銨含量進行L9（33）正交試驗設計，考察各因素對蛋白、總糖含量、纖維素酶活的影響，得出最佳降解條件：藻粉3 g/L，料液比1∶15（g∶mL），硫酸銨20 g/L，磷酸二氫鉀1 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，緩沖液pH 6.0，發酵溫度為30℃，發酵時間為7 d，在此條件下，蛋白含量為12.44 g/100 g，總糖含量0.58 mg/g，纖維素酶酶活4.84 U/g。

剛毛藻；青霉菌；降解；纖維素

海藻作為可再生資源數量巨大，而且是可開發利用的重要資源［1］。在地球上通過藻類的光合作用每年產生的物質有40%。大部分海藻的主要成分是多糖等營養物質，約有50%～60%，纖維素、半纖維和少量的木質素占40%～50%，還有少量灰分。以藻類作為原料開發生物活性物質，其資源豐富，且具有藻體比較柔軟、本身機械強度較低，容易破碎和降解，對設備要求低等優點［2］。提高海藻資源的利用率，以充分實現海藻的價值，是海藻資源開發利用的重要內容［3-4］。我國的海藻養殖技術居于世界領先地位。據聯合國糧農組織（food and agriculture organization of the united nations，FAO）的統計，中國海帶養殖產量占到世界的70%以上［5］。海洋被認為是21世紀支撐未來社會經濟發展的重要物質基礎，海洋資源的開發利用已成為各國可持續發展的重要戰略［6］。

剛毛藻屬于綠藻門，剛毛藻科，不僅種類繁多，而且分布廣泛，在海水、淡水中都存在。剛毛藻中纖維素含量較高，其纖維素、半纖維素、木質素、水分和灰分含量分別為31.2%、17.1%、13.6%、5.83%和26.5%。楊楠楠等［7］研究了剛毛藻纖維素的酶解工藝。剛毛藻生長控制條件的報道較多［8］，利用霉菌產生纖維素酶直接降解剛毛藻中纖維素少見報道，更多的研究集中在里氏木霉、綠色木霉等菌種產纖維素酶能力和酶學分析上［9-10］。本試驗研究青霉菌降解剛毛藻中纖維素，以期為剛毛藻中糖類及蛋白質等生物活性物質的提取分離提供方法和理論依據。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

剛毛藻：采集于濱海海洋刺參養殖池塘，晾干后機械粉碎，過40目篩，備用。

青霉菌：自行從雞糞中篩選得到的青霉菌，濟寧學院生命科學實驗中心保藏。

酵母膏、瓊脂、蛋白胨（生化試劑）：北京奧博星生物技術有限責任公司；葡萄糖、硫酸銨、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、硝酸鈉、苯酚、硫酸銅、硫酸鉀、氫氧化鈉（分析純）：天津市大茂化學試劑廠。

斜面培養基采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（potato dextrose agar，PDA）：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂20g/L，pH自然；種子培養基（PDA培養基）：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20L，pH自然；發酵培養基：藻粉3g/L，硫酸銨10 g/L，酵母膏1 g/L，磷酸二氫鉀1 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，料液比1∶15（g∶mL），pH 5.0。

1.2儀器與設備

DELTA320pH計：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；PL203電子精密天平：鞏義市予華儀器有限責任公司；THZ-100恒溫培養搖床：上海一恒科學儀器有限公司；ST16高速離心機：北京聯合科力科技有限公司；HYP-1004消化爐、102C定氮儀：上海纖檢儀器有限公司；722可見分光光度計：上海菁華科學儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1培養方法

將4℃冰箱保存的青霉菌接種于試管斜面培養基30℃培養3 d，每支斜面菌種加無菌水5 mL，取1 mL轉接入100 mL/250 mL三角瓶種子培養基中，180 r/min、30℃搖床培養1 d作為種子，按10%的接種量轉接入100 mL/250 mL三角瓶發酵培養基中，30℃、150 r/min培養7 d，4 000 r/min離心5 min，離心結束后取上清液測定總糖含量和酶活，余下的固體用烘箱干燥，干燥完成后用研缽研粹固體并取一定量測定蛋白質含量。

1.3.2單因素試驗

氮源種類：在發酵培養基中，分別以酵母膏、蛋白胨、硝酸鈉代替培養基中的硫酸銨為氮源，含量為10 g/L，其他成分不變，考察氮源種類對發酵的影響。

硫酸銨質量濃度：在發酵培養基中，分別按照5 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L、25 g/L添加硫酸銨，其他成分不變，考察硫酸銨質量濃度對發酵的影響。

pH值：將發酵培養基的pH分別調整為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，考察pH值對發酵的影響，其他成分不變，考察pH對發酵的影響。

料液比：將發酵培養基的料液比分別調整為1∶6、1∶9、1∶12、1∶15、1∶18（g∶mL），其他成分不變，考察料液比對發酵的影響。

發酵時間：將發酵時間分別設定為4 d、5 d、6 d、7 d、8 d，考察發酵時間對發酵的影響。

發酵溫度：將發酵溫度分別設定為15℃、25℃、30℃、35℃、40℃，考察發酵溫度對發酵的影響。

1.3.3正交試驗

在單因素試驗的基礎上，以發酵液中的蛋白含量、總糖含量、酶活為評價指標，以pH值、料液比和硫酸氨質量濃度為評價因素進行3因素3水平L9（33）正交試驗，各因素與水平見表1。

表1　霉菌發酵工藝優化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for Penicilliumfermentation technology optimization

1.3.4測定方法

總糖的測定：按照參考文獻［11］的方法進行；羧甲基纖維素鈉（carboxyl methyl cellulose-Na，CMC-Na）酶活性的測定：按照參考文獻［12-14］的方法進行；酶活定義：在酶催化的最適溫度和最適pH條件下，每分鐘催化纖維素水解生成1 μmol葡萄糖的酶量為1個酶活單位（U/g）；蛋白質的測定：按照參考文獻［15］的方法進行。

2　結果與分析

2.1氮源種類對發酵的影響

圖1　氮源種類對發酵的影響Fig.1 Effect of nitrogen sources on fermentation

由圖1可知，以酵母膏作為氮源時，發酵結束時總糖含量最高，為0.28 mg/g，其次是硫酸銨，但總糖含量差距不大，而硫酸銨比酵母膏價格便宜，經濟實惠，使用方便，酵母膏是粘稠狀半固體不容易取；發酵液中以硫酸銨作為氮源時蛋白質含量最高，為13.89 g/100 g，其次是硝酸鈉，彼此蛋白質含量差距較大，影響顯著；發酵液中以蛋白胨為氮源時，纖維素酶酶活最高，為10.90 U/g，其次是硝酸鈉，可能是由于蛋白胨和硝酸鈉為氮源時產酶高峰期較晚，因此酶活高、總糖低；而硫酸銨和酵母膏產酶較早，因此酶活低、總糖高。綜合各方面考慮，選擇硫酸銨為最適氮源。

2.2硫酸銨質量濃度對發酵的影響

由圖2可知，隨著硫酸銨質量濃度的增加，發酵液中粗蛋白含量也增加，在硫酸銨質量濃度＞15 g/L后，粗蛋白含量增加不明顯；這是因為菌在生長過程中要利用氮源生長。由于在霉菌生長過程中糖既可被利用，又可生成，因此變化趨勢不明顯，集中在0.35～0.45 mg/g；纖維素酶酶活在硫酸銨質量濃度為15 g/L時最高，為11.25 U/g，原因可能是菌體生長到一定時期，達到了產酶的高峰。綜合各方面考慮，選擇硫酸銨質量濃度為15 g/L。

圖2　硫酸銨含量對發酵的影響Fig.2 Effect of ammonium sulfate content on fermentation

2.3 pH對發酵的影響

圖3　pH對發酵的影響Fig.3 Effect of pH on fermentation

由圖3可知，在pH為5.0時，粗蛋白含量最高，達到10.72g/100 g；在pH為3.0時，總糖含量最高，達到0.91 mg/g，發酵初期，發酵液中存在的單糖抑制了纖維素酶的產生，產生了葡萄糖效應，故總糖含量比其他同階段生長的要高。酶活在pH 5.0時最高，達到5.87 U/g。綜合各方面考慮，選擇pH5.0為最適pH值。

2.4料液比對發酵的影響

圖4　料液比對發酵的影響Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on fermentation

由圖4可知，隨料液比的增大，粗蛋白含量由7.05 g/100 g增加至9g/100g；總糖含量變化較小；酶活起初變化不明顯，料液比由1∶9（g∶mL）增加到1∶12（g∶mL），增長較為明顯，由5.98 U/g增加至6.68 U/g，料液比高于1∶12（g∶mL）以后，增加緩慢，最終達到6.97 U/g。增大料液比，會降低降解后各種活性物質的提取效果，同時還會增加水的用量，增加提取成本，綜合以上情況，料液比選擇1∶12（g∶mL）較為合適。

2.5發酵時間對發酵的影響

圖5　發酵時間對發酵的影響Fig.5 Effect of fermentation time on fermentation

由圖5可知，隨著培養時間的增加，霉菌生長蛋白質含量、酶活和總糖含量均逐漸增加，在第7天時均達到最高，纖維素酶活為5.41 U/g，蛋白質含量為8.66 g/100 g，總糖含量達到0.76 mg/g，第8天時蛋白質含量減少，可能是因為隨菌體的生長蛋白質含量增加，在菌體死亡自溶時蛋白質含量減少；酶活增加是因為菌體生長到一定時期會產纖維素酶，到第8天時減少可能是纖維素酶被分解了；總糖含量的變化趨勢與蛋白相似，因為霉菌產的纖維素酶是胞外酶，分解剛毛藻中的纖維素使得總糖含量一直增加，在第8天的時候糖減少，可能是因為糖被利用了。綜合來看，發酵時間選擇7 d較為合適。

2.6發酵溫度對發酵的影響

圖6　發酵溫度對發酵的影響Fig.6 Effects of fermentation temperature on fermentation

由圖6可知，粗蛋白及纖維素酶活均隨發酵溫度先增加后減少，在30℃的時候最高，粗蛋白含量為8.78 g/100 g，纖維素酶活為7.54U/g。發酵溫度過高，導致纖維素酶酶活失活。總糖含量的變化不大，在30℃最高，為0.34 mg/g。因此選擇30℃為最適發酵溫度。

2.7霉菌發酵工藝優化正交試驗

以發酵液中的粗蛋白含量、總糖含量、纖維素酶酶活為測定指標，對pH值、料液比和硫酸銨質量濃度3個因素進行L9（33）正交試驗。結果見表2。

表2　霉菌發酵工藝優化正交試驗結果及分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for mold fermentation technology optimization

由表2的極差分析可知，當以蛋白含量為評價指標時，各因素影響的主次順序為氮源質量濃度＞pH＞料液比，最優組合為A1B3C3。當以總糖含量為評價指標時，因素的主次順序為氮源濃度〉料液比〉pH，最優組合為A3B3C3。當以纖維素酶活為評價指標時，因素的主次順序為氮源濃度＞pH＞料液比，最優組合為A1B1C3。因3組組合不統一，需進行驗證試驗。

2.8驗證試驗

由于研究的是青霉菌對剛毛藻的降解情況，所以糖的含量是一個重要的指標，總糖含量越大代表纖維素被酶降解的程度越高，分別在上述3個最優組合條件下做驗證試驗，檢測發酵液中總糖的含量分別為0.43 mg/g、0.58 mg/g、0.34 mg/g。所以選擇青霉菌的降解最佳條件為C3B3A3，即pH值為6.0，料液比為1∶15（g∶mL），硫酸銨質量濃度20 g/L。在該條件下發酵液中蛋白含量為12.44 g/100 g，總糖含量0.58 mg/g，纖維素酶酶活4.84 U/g。

3　結論

本試驗主要研究利用青霉菌進行剛毛藻中纖維素的降解，試驗表明降解的最佳條件為藻粉3 g，發酵溫度30℃，料液比1∶15（g∶mL），硫酸銨質量濃度20 g/L，磷酸二氫鉀1.0 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，緩沖液pH 6.0，結果是蛋白含量為12.44g/100 g，總糖含量0.58 mg/g，纖維素酶酶活4.84 U/g。各因素對纖維素酶活、總糖和粗蛋白的影響不同，因此在討論菌株對海藻中纖維素降解因素時，需要定義具體的發酵條件，本試驗利用霉菌對剛毛藻纖維素降解只是進行了初步探討，降解后對其生物活性物質的分離提取的影響有待進一步研究，希望在此基礎上，為海藻中生物活性成分的高效提取提供幫助。

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Degradation of cellulose inCladophorabyPenicillium

LIANG Baodong1，WEI Haixiang1，BIAN Qingpeng1，JIANG Shuzhe2
（1.Department of Life Science and Engineering，Jining University，Qufu 273155，China；2.College of Life Science，Shandong University，Jinan 250013，China）

The degradation conditions of cellulose inCladophorabyPenicilliumwere researched.The effects of the nitrogen sources，ammonium sulfate content，solid-liquid ratio，pH，fermentation temperature and time on cellulose degradation were researched by single factor experiments.The effects of pH，solid-liquid ratio and ammonium sulfate content on protein content，total sugar content and cellulase activity were investigated by L9（33）orthogonal experiments.The optimum degradation conditions were algae powder 3 g/L，solid-liquid ratio 1∶15（g∶ml），ammonium sulfate 20 g/L，potassium dihydrogen phosphate 1 g/L，magnesium sulfate 0.5 g/L，buffer solution pH 6.0，fermentation temperature 30℃and time 7 d.Under the conditions，protein content，total sugar content and cellulase activity were 12.44 g/100 g，0.58 mg/g and 4.84 U/g，respectively.

Cladophora；Penicillium；degradation；cellulose

TS254.2

0254-5071（2016）07-0131-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.07.028

2016-03-09

濟寧市產學研合作計劃項目（2014jnkj02）

梁寶東（1979-），男，講師，碩士，研究方向為微生物發酵及生物活性物質。