生物降解九資河茯苓多糖的HPLC圖譜分析

王知龍，張夢夢，高　帆，葉　晶，吳　鵬

生物降解九資河茯苓多糖的HPLC圖譜分析

王知龍，張夢夢，高帆，葉晶，吳鵬*

（黃岡師范學院 生命科學學院，經(jīng)濟林木種質(zhì)改良與資源綜合利用湖北省重點實驗室，大別山特色資源開發(fā)湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 黃岡 438000）

通過柱前衍生化高效液相色譜（HPLC）法分析生物降解茯苓多糖的組分。選用黑曲霉HS-5液體發(fā)酵，生物降解茯苓多糖。粗多糖液經(jīng)濃縮、Sevage法純化、真空干燥處理得到多糖固體樣品。利用紅外光譜（IR）和紫外光譜（UV）分析鑒定多糖，采用PMP柱前衍生化HPLC法分析，通過與對照品的出峰時間比較，確定其分子中的單糖組成與含量分別為：甘露糖5.463%、鼠李糖8.970%、D-木糖52.809%。

茯苓多糖；生物降解；紫外光譜；紅外光譜；高效液相色譜

茯苓（Poria cocos）是傳統(tǒng)的藥食兩用食材，其味甘、淡、性平，具有利水滲濕、健脾和胃、寧心安神之功，是多種方劑及中成藥的原料，又有“十藥九茯苓”一說［1］。除了中醫(yī)治療藥用外，還可制成多種保健食品［2-3］。因此，對茯苓的深度研究不僅具有學術(shù)價值，還具有實際生產(chǎn)意義。茯苓的有效成分主要為茯苓多糖［4］，茯苓多糖具有抗腫瘤、增強機體免疫力、抗病毒、消石等作用，并廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、保健和食品等方面［5-7］。茯苓主要分布在云南、湖北、安徽、山東、河南等省，其中湖北九資河茯苓以質(zhì)量好，藥用價值高，在國內(nèi)外市場享有很高的聲譽。目前，國內(nèi)外對茯苓多糖的研究主要集中在其結(jié)構(gòu)與活性的構(gòu)效關(guān)系上，進而對其修飾改造，使其活性更強。本試驗以九資河茯苓為原材料，采用生物降解法水解茯苓多糖，并采用柱前衍生化高效液相色譜（highperformanceliquidchromatography，HPLC）法對其結(jié)構(gòu)組分進行分析研究，為九資河茯苓多糖的進一步研究和開發(fā)利用提供科學依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

黑曲霉（Aspergillus niger）HS-5：黃岡師范學院食品加工技術(shù)實驗室。濃硫酸、石油醚、無水乙醇、濃鹽酸、三氟乙酸、醋酸酐、甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methyl-5-pyrazalone，PMP）：國藥集團化學試劑有限公司。

黑曲霉HS-5產(chǎn)β-葡聚糖酶培養(yǎng)基：大麥粉3%、酵母膏2%、碳酸鈣0.3%、抗壞血酸0.1%、乙酸鈉0.1%、硝酸銨0.14%、硫酸鎂0.05%、硫酸亞鐵0.000 1%、磷酸氫二鉀0.1%。分裝，滅菌，滅菌條件0.1 MPa、20 min。

1.2儀器與設(shè)備

RB-CJ-1ND型超凈工作臺：北京瑞邦興業(yè)科技有限公司；TG16-WS臺式高速離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；D2F-6020真空干燥箱：上海景宏實驗設(shè)備有限公司；UV2600紫外可見分光光度計、LC-20A高效液相色譜分析儀：島津企業(yè)管理（中國）有限公司；SP-723型可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司；Nicolet-6700傅立葉紅外光譜儀：美國熱電有限公司。

1.3方法

1.3.1原材料的預處理

九資河茯苓置于溫度為105℃的烘箱進行烘干，至含水量不超過2%，將干燥后的茯苓用粉碎機進行粉碎，過60目篩，并收集過篩后的茯苓粉末，室溫貯藏于密封塑料袋中備用。

緩沖液的配制：稱取檸檬酸19.21g，加水溶解至1000mL容量瓶中，定容，得0.1 mol/L檸檬酸溶液；稱取檸檬酸鈉29.41 g加水溶解至1 000 mL容量瓶中，定容得0.1 mol/L檸檬酸鈉溶液。

3，5二硝基水楊酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）試劑的配制：稱取3，5-二硝基水楊酸10 g，置于約600 mL水中，逐漸加入氫氧化鈉10 g，在50℃水浴中（磁力）攪拌溶解，再依次加入酒石酸鉀鈉200 g，苯酚2 g和無水亞硫酸鈉5 g，待全部溶解并澄清后，冷卻至室溫，用水定容至1 000 mL。過濾貯存于棕色試劑瓶中，于暗處放置7 d后使用。

1.3.2茯苓粗多糖的提取

根據(jù)文獻［8-10］中得出的最佳工藝，本實驗選用黑曲霉HS-5降解茯苓多糖。主要操作如下：

（1）β-葡聚糖酶液的制備

接種黑曲霉HS-5至β-葡聚糖酶培養(yǎng)基中，擴培，將擴培菌種接種于盛有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角燒瓶中，置于30℃、200 r/min旋轉(zhuǎn)式搖床上控溫發(fā)酵，發(fā)酵48 h。過濾后得到粗酶液，采用硫酸銨分級沉淀、透析濃縮、采用Sephadex G-100柱層析對其進行分離純化，得到了β-葡聚糖酶液。

（2）生物降解茯苓多糖

本試驗通過改進郭雨桐等［18］的技術(shù)參數(shù)得到生物降解茯苓多糖的最優(yōu)技術(shù)參數(shù)：反應(yīng)溫度55℃、時間120min、pH 5.0、β-葡聚糖酶量20 mL。在該參數(shù)條件下，用DNS法測得β-葡聚糖酶的酶活達20.03 U/mL，苯酚-硫酸法測得茯苓多糖的提取率為18.074%。

（3）DNS法測定β-葡聚糖酶酶活

本實驗以葡聚糖為底物，DNS顯色，光電比色法于波長520 nm處測定β-葡聚糖酶酶活。

酶活力定義：在本試驗條件下，每分鐘分解β-葡聚糖產(chǎn)生相當于l μmol葡萄糖所需的酶蛋白的量定義為一個酶活單位。此法測得β-葡聚糖酶的酶活達20.03 U/mL。

（4）粗多糖的提取

根據(jù)本項目前期研究結(jié)果，取2g茯苓粉末于錐形瓶中，加60 mL緩沖液（pH5.0），再加入20 mL酶液，最后以10 mL緩沖液清洗盛酶液的容器并倒入錐形瓶中。在55℃條件下反應(yīng)120 min。反應(yīng)結(jié)束后將采用高壓蒸汽滅菌法將酶滅活，抽濾得到粗多糖液，然后采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)濃縮，低溫真空干燥，從而得到茯苓多糖粗品。

1.3.3苯酚-硫酸法測定多糖含量

吸取1.0mL稀釋樣品液加入20mL試管中，再加入2mL 5%的苯酚、6 mL濃硫酸，放置30 min，于波長490 nm處測其吸光度值，對照標準曲線［13］，計算多糖含量。

1.3.4茯苓多糖的純化

粗多糖中含有較多的游離蛋白，在多糖的分離提取中，有機溶劑能夠使游離蛋白變性沉淀，從而達到純化的目的。

本實驗采用Sevage法反復除蛋白：取茯苓多糖溶液4mL，加入1 mL氯仿和正丁醇（V（氯仿）∶V（正丁醇）=4∶1），充分振蕩20min，離心去除水層與溶劑層交界的變性蛋白，反復數(shù)次，直至溶劑層與水的界面無乳白色沉淀為止。

1.3.5茯苓多糖的水解與衍生化［11-13］

（1）茯苓多糖的水解

取茯苓多糖樣品40 mg于安瓿瓶中，再加入4 mol/L三氟乙酸溶液1mL，封管后于90℃水解8 h，得水解樣品溶液，轉(zhuǎn)移至EP管中離心，取上清液用0.3 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH至中性。

（2）樣品與單糖標品的PMP衍生化

精確稱取半乳糖、葡萄糖和甘露糖各約0.018 g，鼠李糖約0.016 g，葡糖醛酸約0.019 g，木糖0.015 g溶于0.3 mol/L氫氧化鈉溶液1.0 mL中，配制每種單糖的標準溶液（約為0.1 mol/L），分別取每種單糖的標準溶液100 μL混合，配制混和標準品溶液（每種單糖濃度約為1/60 mol/L）。取標準品溶液或茯苓多糖水解溶液50 μL于EP管中，依次加入PMP溶液（0.5 mol/L甲醇溶液）50 μL和0.3 mol/L氫氧化鈉溶液50 μL，混勻后置于70℃水浴中加熱反應(yīng)30 min。取出室溫放置10 min，再加入0.3 mol/L鹽酸液60 μL中和至酸性，混勻后用0.5 mL三氯甲烷萃取，渦旋3 min，5 000 r/min離心15 min，小心棄去有機層（下層），萃取3次，5 000 r/min離心15 min，上清液加水至500 μL混勻，過膜后，用于HPLC分析。

1.3.6 HPLC分析單糖組成

色譜分析條件［14］：檢測波長為250 nm。柱溫為室溫，流速1.0 mL/min，流動相：溶劑A，15%（V/V）乙腈+0.05 mol/L磷酸緩沖液（KH2PO4-NaOH，pH 6.9）、溶劑B，40%（V/V）。乙腈+0.05 mol/L磷酸緩沖液（KH2PO4-NaOH，pH6.9），時間梯度為0→10min→30min，相應(yīng)濃度梯度為0→8%→20%溶劑B；進樣體積10 μL。

1.3.7紅外光譜分析

采用KBr壓片法在Nicolet-6700傅立葉紅外光譜儀波數(shù)400～4 000 cm-1范圍進行掃描分析。

1.3.8紫外光譜分析

采用固體樣品掃描法，用島津UV2600紫外可見分光光度計進行掃描，掃描波長為190～600 nm。

2　結(jié)果與分析

2.1紅外光譜結(jié)果分析

如圖1所得的紅外圖譜顯示，3 483 cm-1處強且寬的吸收峰是O-H與C-H的伸縮振動，為糖類物質(zhì)的特征吸收；2 981 cm-1處的吸收峰是C-H的伸縮振動；1 585 cm-1處的吸收峰是O-H的彎曲振動吸收峰；1 442 cm-1和1 392 cm-1處的吸收峰是次甲基（=CH2）的變形吸收峰；1 267 cm-1是吡喃糖環(huán)C-O-C伸縮振動吸收峰；1 131cm-1是吡喃糖環(huán)的C-O吸收峰，1 080 cm-1和1027 cm-1是O-H的變角振動吸收峰，881 cm-1為β型糖苷鍵的吸收峰［15-17］，740 cm-1為吡喃糖環(huán)的C-O-C的對稱振動峰。586 cm-1和509 cm-1是C-CO的變形振動吸收峰。由此表明，提取的多糖樣品是β-D-構(gòu)型的多糖。

圖1　茯苓多糖紅外掃描圖譜Fig.1 Infrared scanning spectrum of pachymaran

2.2紫外光譜分析

圖2為生物降解法提取的茯苓多糖紫外掃描圖譜，可見在波長204 nm處有典型的糖類物質(zhì)特征吸收峰［16］。

圖2　生物降解得到的茯苓多糖的紫外吸收光譜Fig.2 UV absorption spectrum of pachymaran by biodegradation

2.3 HPLC分析單糖組成

生物降解茯苓多糖的多糖樣品經(jīng)過水解、PMP衍生化后，經(jīng)高效液相色譜儀分析得到的色譜如圖3所示；參照相同HPLC分析方法下屈賀冪［13］得出的混合標準單糖PMP衍生物高效液相色譜圖，可知茯苓多糖樣品HPLC色譜圖中2.712 min處出峰對應(yīng)的是PMP；4.065 min出的峰對應(yīng)的是甘露糖；5.301 min處出峰對應(yīng)的是鼠李糖；11.755 min時出的峰對應(yīng)的是D-木糖。

圖3　混合標準單糖PMP衍生物高效液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of mixed standard monosaccharide PMP derivative

根據(jù)色譜圖中的出峰時間與峰面積，可以得出生物降解的九資河茯苓多糖含有的單糖組分與含量依次為：甘露糖5.463%、鼠李糖8.970%、D-木糖52.809%。

3　結(jié)論

多糖的提取方法有許多種，但是傳統(tǒng)方法多糖提取率一般都不高而且提取時間較長。本試驗選用黑曲霉液體發(fā)酵，定向高產(chǎn)β-葡聚糖酶為外源酶降解茯苓得到多糖溶液。β-葡聚糖酶可最大限度的將茯苓多糖中的葡聚糖聚合體降解為還原糖和寡糖，從而提高茯苓多糖的提取率，為茯苓多糖的開發(fā)利用提供依據(jù)。

經(jīng)初步純化后的茯苓多糖采用PMP柱前衍生化HPLC法分析，通過與對照品的出峰時間比較，最后確定其分子中的單糖。HPLC圖譜分析結(jié)果顯示，生物降解九資河茯苓多糖的單糖組成與含量為甘露糖5.463%、鼠李糖8.970%、D-木糖52.809%。

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HPLC chromatogram analysis of Jiuzihe pachymaran by biodegradation

WANG Zhilong，ZHANG Mengmeng，GAO Fan，YE Jing，WU Peng*
（Hubei Collaborative Innovation Center for the Characteristic Resources Exploitation of Dabie Mountains，Hubei Key Laboratory of Economic Forest Germplasm Improvement and Resources Comprehensive Utilization，College of Life Sciences，Huanggang Normal University，Huanggang 438000，China）

The pachymaran components by biodegradation were analyzed by HPLC with pre-column derivatization.UsingAspergillus nigerHS-5 as fermentation strains to conduct liquid-state fermentation，pachymaran was degraded by biodegradation.Pachymaran solid sample was obtained by concentrating crude sugar，sevage purification and vacuum drying.Pachymaran solid sample was analyzed and identified by infrared spectroscopy（IR）and ultraviolet spectroscopy（UV），then using HPLC analysis with PMP column derivatization，by comparison with the peak time of the standard，the monosaccharide composition and contents were determined as follows：mannose 5.463%，rhamnose 8.970%，D-xylose 52.809%.

pachymaran；biodegradation；ultraviolet spectroscopy；infrared spectrum；HPLC

O657

0254-5071（2016）07-0139-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.07.030

2016-03-03

湖北省自然科學基金項目（2013CFB472）；校生物示范中心項目（zx201422）

王知龍（1994-），男，本科，研究方向為食品生物技術(shù)和農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏。

吳鵬（1982-），女，副教授，博士，研究方向為食品生物技術(shù)和農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏。