缺氧對紅曲霉桔霉素相關基因表達量及產量的影響

馬博雅，張　佳，王雪蓮，王昌祿（.天津科技大學 食品工程與生物技術學院，食品營養與安全教育部重點實驗室，天津 300457；.廊坊出入境檢驗檢疫局，河北 廊坊 065000）

缺氧對紅曲霉桔霉素相關基因表達量及產量的影響

馬博雅1，2，張佳2，王雪蓮2，王昌祿1*
（1.天津科技大學 食品工程與生物技術學院，食品營養與安全教育部重點實驗室，天津 300457；2.廊坊出入境檢驗檢疫局，河北 廊坊 065000）

為了比較有氧與缺氧條件下與桔霉素合成相關的3個基因表達量的差異及探討桔霉素產量與相關基因表達量之間的對應關系，將高產桔霉素的紅曲霉MX1分別置于有氧及缺氧條件下培養20 d，動態監測桔霉素產量及相關基因表達量的變化。有氧條件下桔霉素產量及相關基因表達量均呈現先升高后降低的趨勢且均在第8天達到峰值；缺氧條件下，桔霉素產量一直處于較低狀態且終產量比有氧條件下低40.16%，ctnA基因的表達量總是低于有氧條件，而orf7基因的表達量總是高于有氧條件，pksCT基因的表達量沒有呈現明顯的規律性。結果表明，缺氧條件可能是通過抑制ctnA基因的表達和促進orf7基因的表達來抑制桔霉素的合成，而pksCT基因不是調控桔霉素合成的關鍵基因。

紅曲霉；桔霉素；缺氧；基因表達量

紅曲霉（Monascus）在食品工業中的應用已有悠久的歷史。近年來，由于它能夠生成多種生理活性物質而備受各國專家學者的關注［1］。然而，紅曲霉在產生對人體有益的生物活性物質的同時，還會產生一種真菌毒素—桔霉素。桔霉素主要作用于腎臟，不僅可以致畸、致癌，而且可以誘發突變［2-3］。

紅曲霉桔霉素的產量受到各種外界環境因子的影響，如培養基種類［4-6］、溫度［7］、光照［8-9］、pH［10］、物理化學誘變［11］、溶解氧［12］等。紅曲霉屬于好氧微生物，發酵液中的溶解氧直接影響著紅曲霉的生長以及次生代謝產物合成。通氣培養紅曲霉有利于菌絲體生長及活性物質生成，但桔霉素的產量提高的更為顯著。因此，低氧氣轉換系數是降低桔霉素產量的重要因素。

紅曲霉菌產生的桔霉素屬于聚酮類化合物，由聚酮合酶（polyketide synthase，PKS）基因編碼合成。目前，與桔霉素合成相關的PKS基因和相應基因簇的相關序列測定及功能分析已有報道。SHIMIZU T等［13-15］根據真菌PKS保守區設計簡并引物，從紫色紅曲菌（Monascus purpureus）中克隆得到一段13 kbp的基因組片段，得到桔霉素合成相關的PKS基因（pksCT）全長，隨后又克隆了pksCT基因的兩側序列，得到一個21 kbp桔霉素合成相關基因簇（共6個基因，其中包括ctnA）。LI Y P等［16］對橙色紅曲菌（Monascus aurantiacus）基因組文庫進行篩選，對獲得的克隆子進行測序分析后，得到長約43kbp的序列，除了包含SHIMIZUT等［13］報道的6個基因外，還有10個新發現的開放閱讀框架（openreadingframe，ORF）（包括orf7）。

雖然國內外學者已經對紅曲霉桔霉素進行的比較深入的研究，然而在缺氧環境誘導下桔霉素產量與其合成相關基因表達量的對應關系的研究卻鮮有報道。本研究從缺氧對紅曲霉桔霉素產量及其報道的桔霉素合成相關的3個基因（ctnA，pksCT，orf7）的表達量影響入手，從基因表達角度解釋缺氧環境誘導紅曲霉桔霉素代謝機理，為真菌的次生代謝途徑研究提供理論依據。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌株

紅曲霉（Monascus）MX1：天津科技大學食品工程與生物技術學院食品生物技術實驗室保藏。

1.1.2培養基

菌種保藏培養基：麥芽汁（糖度10～12°Bx），瓊脂粉2%。

種子培養基：葡萄糖60 g/L，蛋白胨20 g/L，NaNO310 g/L，MgSO4·7H2O 5 g/L，KH2PO410 g/L。

發酵培養基：蔗糖160 g/L，酵母浸粉40 g/L。

以上培養基均采用高壓蒸汽滅菌，121℃、20 min。

1.1.3化學試劑

乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純）：德國Merck公司；超純水：娃哈哈集團有限公司；桔霉素標準品（純度99%）：美國Sigma公司。

1.2儀器與設備

1260高效液相色譜儀、MX3000P實時熒光定量PCR儀：美國Agilent公司；YQX-Ⅱ型厭氧培養箱：上海新苗醫療器械制造有限公司。

1.3方法

1.3.1培養條件及方法

將菌種接種于斜面培養基，30℃恒溫培養4 d，制成濃度為2×106個/mL孢子懸浮液，以每瓶5 mL接種于50 mL發酵培養基中，搖勻，分別置于有氧與缺氧條件下進行培養，每個樣品做3個平行。下層發酵液用于桔霉素的測定，上層菌絲體用于核糖核酸（ribose nucleic acid，RNA）的提取及生物量的測定。

1.3.2樣品處理

準確吸取0.5 mL紅曲發酵液，放入10 mL容量瓶中，用無水乙醇定容至10 mL，混勻后60℃水浴1 h，水浴過程中每隔10 min顛倒混勻一次，5 000 r/min離心15 min，取上清液，經0.22 μm濾膜過濾后備用。

1.3.3桔霉素含量檢測高效液相色譜條件

色譜柱：Agilent TC-C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流動相：乙腈∶甲醇∶水=70∶10∶20（V/V），放置過夜，用磷酸調pH 2.66～2.68；熒光檢測器，λex=331 nm，λem=500 nm；柱溫：25℃；流速：1 mL/min；進樣量：20 μL。

1.3.4桔霉素標準曲線的繪制

準確稱取5.00 mg桔霉素標準品用色譜純乙腈定容至10 mL，得到質量濃度為500 μg/mL的桔霉素標準母液，配制成質量濃度為0、0.10 μg/mL、0.25 μg/mL、2.00 μg/mL、5.00 μg/mL、10.00 μg/mL的桔霉素標準溶液，經0.22 μm濾膜過濾后備用。

1.3.5桔霉素合成相關基因表達量測定方法

Takara RNA提取試劑盒、Takara反轉錄試劑盒進行RNA的提取及反轉錄。以美國國家生物技術信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）上報道的紅曲霉桔霉素合成相關各基因序列為參考序列，ctnA（No.AB243687），pksCT（No.AB167465），orf7（No.EU309474）以及內參基因actin（No.AJ417880），用NCBIPrimer-BLAST設計引物，用以擴增紅曲霉MX1上述3個基因。采用SYBR Green染色，實時熒光定量PCR（real time fluorogenic quanti tativePCR，RT-qPCR）方法對紅曲霉桔霉素合成相關基因相對表達量進行監控。PCR擴增程序：95℃、30 s；95℃、5 s，60℃、30 s，72℃、30 s，42個循環。

2　結果與分析

2.1桔霉素含量及紅曲霉產量的測定

桔霉素標準品的高效液相色譜圖如圖1所示，桔霉素標準品的保留時間為4.830 min。

圖1　桔霉素標品HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of citrinin standard

桔霉素標準曲線如圖2所示。由標準曲線求得峰面積（y）對桔霉素質量濃度（x）的線性回歸方程為：y=58.06x，相關系數R2=0.999 4。結果表明，二者線性關系良好。

紅曲霉發酵樣品的液相色譜圖如圖3所示，紅曲霉發酵樣品中桔霉素保留時間為4.828 min。按照桔霉素標準回歸方程計算發酵液中桔霉素含量（以mg/g干菌質量計），紅曲霉菌絲體烘干至恒質量，作為干菌質量即生物量。

圖2　桔霉素標準曲線Fig.2 Standard curve of citrinin

圖3　發酵樣品HPLC色譜圖Fig.3 HPLC of fermentation sample

2.2缺氧對紅曲霉桔霉素產量的影響

按1.3.1的方法將紅曲霉MX1置于有氧培養箱及厭氧培養箱，30℃恒溫培養20d，生物量及桔霉素產量結果見圖4。

圖4　有氧與缺氧條件下生物量和桔霉素產量Fig.4 Biomass and citrinin yield under aerobic and anaerobic conditions

由圖4可知，在有氧條件下，桔霉素產量呈現先升高后降低的趨勢，在第8天達到峰值，為6.64 mg/g干菌質量，發酵最后桔霉素產量降低至2.54 mg/g干菌質量；而在缺氧條件下，桔霉素產量一直處于較低的水平，在第18天產量最高，為2.13 mg/g干菌質量，發酵終產量為1.52 mg/g干菌質量，比有氧條件下低40.16%。

結果表明，在缺氧條件下，紅曲霉MX1桔霉素產量顯著低于有氧條件，生產上可以通過控制通氧量來抑制桔霉素的產量。

2.3缺氧對紅曲霉桔霉素合成相關基因表達量的影響

按1.3.5的方法設計RT-qPCR實驗所用引物，引物序列如表1所示。

表1　RT-qPCR實驗所用引物Table 1 Primers for RT-qPCR

按照1.3.5的方法，以actin作為內參基因，以有氧條件下培養至第6天時各基因表達量為單位1，比較有氧條件與缺氧條件下桔霉素合成相關基因表達量的差異，基因相對表達量測定結果如圖5所示。

由圖5可知，在有氧條件下，3個基因的表達量都呈現先升高后降低的趨勢，而且都是在第8天達到最高值，這與桔霉素產量變化趨勢一致。在缺氧條件下，只有ctnA基因表達量與桔霉素產量變化趨勢呈正相關且與有氧條件相比一直處于較低水平，pksCT基因的表達量沒有表現出明顯的規律性，orf7基因的表達量隨著培養時間的延長而增加且一直高于有氧條件。

由圖5可知，在有氧條件下，3個基因的表達量都呈現先升高后降低的趨勢，而且都是在第8天達到最高值，這與桔霉素產量變化趨勢一致。但在缺氧條件培養下，各基因表達量的變化各有不同，缺氧條件打亂了相關基因表達量與桔霉素產量之間的對應關系。在缺氧條件下，ctnA基因表達量與桔霉素產量變化趨勢呈正相關且與有氧條件相比一直處于較低水平。ctnA基因編碼鋅指轉錄因子，是桔霉素合成途徑中的激活因子［14，17］。缺氧條件可能是通過抑制ctnA基因的表達來抑制桔霉素的合成。pksCT基因是第一個被發現的與桔霉素合成相關的基因，一度被認為是調控桔霉素合成的關鍵基因［13，18-20］。本試驗中，在缺氧條件下該基因的表達量沒有表現出明顯的規律性，這表明在缺氧條件下，pksCT基因并不是調控桔霉素合成的關鍵基因。值得注意的是，鄒樂花等［21］的研究表明，敲除orf7基因后，桔霉素產量是野生型菌株的2.42倍，orf7基因可能對桔霉素的合成起到抑制作用。由圖5可知，在缺氧條件下orf7基因的表達量與有氧條件相比顯著升高，這同樣表明了缺氧條件可能是通過促進orf7基因的表達來抑制桔霉素的生成。

圖5　缺氧條件對桔霉素合成ctnA（A），pksCT（B）及orf7（C）基因表達量的影響Fig.5 Effect of anaerobic conditions on expression level ofctnA（A），pksCT（B）andorf7（C）genes of the citrinin synthesis

3　結論

缺氧培養可以顯著降低紅曲霉桔霉素的產量。缺氧條件可以抑制ctnA基因的表達、促進orf7基因的表達。缺氧條件可能是通過抑制ctnA基因的表達和促進orf7基因的表達來抑制桔霉素的合成，而pksCT基因不是調控桔霉素合成的關鍵基因。

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Effect of anaerobic condition on the citrinin yields and the expression level of citrinin biosynthetic genes inMonascus

MA Boya1，2，ZHANG Jia2，WANG Xuelian2，WANG Changlu1*
（1.Key Laboratory of Food Nutrition and Safety，Ministry of Education，College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China；2.Langfang Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Langfang 065000，China）

In order to compare the difference of expression level of the three genes involved with citrinin synthesis under aerobic and anaerobic conditions and discuss the corresponding relationship between yield and expression level of genes involved，high citrinin-producingMonascusMX1 was cultured for 20 d under the aerobic and anaerobic conditions，respectively.The changes of citrinin yield and expression level of genes involved were monitored dynamically.Under aerobic conditions，both the citrinin yield and expression level of genes involved first increased，then decreased，and reached their highest levels on the 8th day.While under anaerobic conditions，the citrinin yield was in a low level and the final yield of citrinin was 40.16%lower than that under aerobic conditions.The expression level ofctnAgene under anaerobic conditions was always lower than that under aerobic conditions，while the expression level oforf7gene was higher，and the expression level ofpksCTgene had no obvious regularity.The results showed that anaerobic conditions could inhibitionctnAgene expression and promoteorf7gene expression to inhibit the synthesis of citrinin，but pksCTgene was not the key gene of citrinin synthesis.

Monascus；citrinin；anaerobic conditions；expression level of gene

Q786

0254-5071（2016）07-0143-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.07.031

2016-02-20

國家自然科學基金資助項目（31171729）

馬博雅（1988-），女，碩士研究生，研究方向為食品生物技術。

王昌祿（1960-），男，教授，碩士，研究方向為食品生物技術。