刺五加立枯病內(nèi)生生防菌株的篩選

姜 威，李 晶，孟利強(qiáng)，張淑梅

（1.黑龍江省科學(xué)院高技術(shù)研究院，哈爾濱 150020；2.黑龍江省科學(xué)院微生物研究所，哈爾濱 150010）

刺五加立枯病內(nèi)生生防菌株的篩選

姜 威1，2，李 晶1，2，孟利強(qiáng)1，2，張淑梅1，2

（1.黑龍江省科學(xué)院高技術(shù)研究院，哈爾濱 150020；2.黑龍江省科學(xué)院微生物研究所，哈爾濱 150010）

從健康刺五加植株的根、莖、葉中分離內(nèi)生細(xì)菌，并對(duì)刺五加立枯病有拮抗作用的生防菌株進(jìn)行了篩選。結(jié)果從刺五加各組織中共分離了48株內(nèi)生菌，經(jīng)鑒定分屬于芽孢桿菌屬、假單孢菌屬、黃單孢菌屬及短小桿菌屬。其中有4株內(nèi)生細(xì)菌對(duì)刺五加立枯病有拮抗作用，具有作為生防菌的潛能。

刺五加；內(nèi)生細(xì)菌；拮抗作用

刺五加（Acanthopanax senticosus）是五加科五加屬多年生植物，其根、莖、葉、果實(shí)入藥材，具有強(qiáng)身健體、補(bǔ)腎安神、益氣健脾之功效［1-2］。剌五加中有多種化學(xué)成分，刺五加苷B為其中的主要成分，具有促性腺等作用，可抗疲勞、增強(qiáng)適應(yīng)性［3］。刺五加因?yàn)榫哂酗@著療效和廣泛藥用價(jià)值而越來越受到人們重視，目前全國(guó)年需求量達(dá)到500萬(wàn)kg以上［4］。由于過量采挖，刺五加已經(jīng)瀕臨滅絕，人工種植研究已成為重中之重。但是隨著人工栽培范圍的不斷擴(kuò)大，刺五加病害日益嚴(yán)重［5］。目前，刺五加種植中主要病害為刺五加苗期的立枯病，立枯病致病菌主要為立枯絲核菌，對(duì)刺五加苗期培育造成了嚴(yán)重的影響。苗期立枯病是植物在幼苗階段由立枯絲核菌和鐮刀菌等多種真菌引起的土傳病害，發(fā)生面廣，危害嚴(yán)重［6］。化學(xué)的防治使病原菌產(chǎn)生抗藥性，并且破壞了土壤結(jié)構(gòu)。

本試驗(yàn)從植物體內(nèi)篩選對(duì)植物本身病害具有明顯抑制作用的內(nèi)生細(xì)菌，這些內(nèi)生細(xì)菌可以主動(dòng)從植物體表進(jìn)入植物體內(nèi)，在植物體內(nèi)定殖，能更好地發(fā)揮其促生防病增產(chǎn)作用。因此，從刺五加植物體內(nèi)篩選內(nèi)生生防菌可能成為刺五加立枯病生物防治中重要的環(huán)節(jié)。

1 材料與方法

1.1 材料

培養(yǎng)基：馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基（PDA）馬鈴薯250g，葡萄糖20g，瓊脂20g，水1 000mL。LB培養(yǎng)基胰蛋白胨10g，酵母膏5g，蛋白提取物5g。

樣品來源：刺五加植株采自牡丹江林副特產(chǎn)研究所。

供試病原菌：立枯絲核菌（Acanthopanax senticosus）由黑龍江省森林保護(hù)研究所鄧勛贈(zèng)予。

1.2 方法

1.2.1 采集方法

在牡丹江市林副特產(chǎn)研究所刺五加的種植園區(qū)內(nèi)2個(gè)實(shí)驗(yàn)基地內(nèi)各選擇2塊樣地，在每塊樣地根據(jù)刺五加生長(zhǎng)情況、病蟲害是否發(fā)生以及東西南北不同方向，共采集刺五加健康植株10株。分別采取健康刺五加植株的根、莖、葉組織裝入無(wú)菌自封袋內(nèi)，帶回實(shí)驗(yàn)室4℃保存，盡快分離內(nèi)生細(xì)菌。

1.2.2 消毒劑不同消毒時(shí)間的滅菌效果及檢驗(yàn)

將刺五加各組織用自來水沖洗去除表面雜質(zhì)，然后在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行表面的消毒：無(wú)菌水沖洗表面，濾紙吸去水分，將組織在95%乙醇中浸泡10s，晾干后浸在1%NaCIO溶液中消毒3 min、5 min、7 min、9 min、11 min和13min，無(wú)菌水沖洗3次，最后一次沖洗的無(wú)菌水取100uL涂LB平板，30℃培養(yǎng)24h，檢驗(yàn)滅菌效果，每處理3次重復(fù)。

表面除菌率=（未消毒處理的植物表面細(xì)菌數(shù)-消毒處理的植物表面細(xì)菌數(shù)）/未消毒處理的植物表面細(xì)菌數(shù)100

1.2.3 內(nèi)生細(xì)菌的分離

將消毒后的組織用無(wú)菌研缽磨碎后無(wú)菌水倍比稀釋，取100uL均勻涂抹在LB培養(yǎng)基上，重復(fù)3次，30℃下倒置培養(yǎng)24～48h，觀察菌落生長(zhǎng)情況。挑取不同形態(tài)的菌落純化、鏡檢并保存。

1.2.4 內(nèi)生細(xì)菌種類鑒定

分離的內(nèi)生細(xì)菌的鑒定主要參照《一般細(xì)菌常用鑒定方法》［7］進(jìn)行鑒定。

1.2.5 拮抗菌篩選

內(nèi)生菌的拮抗能力采用平板對(duì)峙培養(yǎng)法篩選。抑菌率（%）=（對(duì)照菌絲直徑-處理菌絲直徑）/對(duì)照菌絲直徑×100

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒時(shí)間的滅菌效果

內(nèi)生菌在分離的過程中，表面滅菌是關(guān)鍵，過輕或過重都會(huì)影響內(nèi)生菌數(shù)量的準(zhǔn)確性［8］。既要避免因?yàn)闇缇鷷r(shí)間過短造成滅菌效果的不徹底，又要預(yù)防滅菌時(shí)間過長(zhǎng)造成植物組織的傷害。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在分離刺五加內(nèi)生細(xì)菌的過程中，2%NaCIO溶液消毒時(shí)間越長(zhǎng)，內(nèi)生細(xì)菌的數(shù)量越少。處理時(shí)間每延長(zhǎng)2min，內(nèi)生菌數(shù)量減少60%。最后結(jié)果顯示5min為滅菌最佳時(shí)間。

2.2 內(nèi)生菌的分離和鑒定

從刺五加的根、莖、葉中分離、純化，獲得內(nèi)生細(xì)菌48株。對(duì)部分出現(xiàn)重復(fù)率較高菌株的菌落形態(tài)、生理生化特性和培養(yǎng)性狀進(jìn)行了測(cè)定。初步鑒定為芽孢桿菌屬、假單孢菌屬、黃單孢菌屬和短小桿菌屬，芽孢桿菌屬出現(xiàn)率最高。內(nèi)生菌不同種屬主要特征如表1。

表1 內(nèi)生細(xì)菌屬的特性Tab.1 The chacteristics of endophytic bacteria strain

2.3 刺五加內(nèi)生拮抗菌株的篩選

用平板對(duì)峙法測(cè)定了48株內(nèi)生細(xì)菌對(duì)刺五加立枯絲核菌的拮抗作用。結(jié)果顯示有4株內(nèi)生細(xì)菌對(duì)立枯絲核菌有抑制作用，抑菌率分別為60.9%，71.2%，68.6%，88.5%。

3 討論

研究表明，刺五加根、莖、葉組織內(nèi)都存在大量的內(nèi)生細(xì)菌。其種群密度分布是根中最多，其次為葉、莖。其中分離的四株拮抗細(xì)菌中，有3株來自刺五加根，1株來自刺五加葉。因此推植物根中內(nèi)生生防菌株的含量可能為最高。內(nèi)生細(xì)菌作為植物生態(tài)系統(tǒng)組成成分，相對(duì)于PGPR、附生細(xì)菌更具備優(yōu)勢(shì)，更又助于生防作用的發(fā)揮。篩選出的生防細(xì)菌的作用如何，需要結(jié)合田間試驗(yàn)加以證實(shí)，為開發(fā)防治刺五加立枯病生防資源提供基礎(chǔ)。

［1］ 程海濤，李春豐，羅志文.刺五加營(yíng)養(yǎng)器官中總皂苷積累動(dòng)態(tài)研究［J］.黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2012，35（2）：40-41.

［2］ 程昆木，鄭友蘭.不同年份刺五加中刺五加苷含量分析［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（30）：14707-14708.

［3］ 張寶香，楊義明，姜英，等.刺五加不同樹齡與不同采收期折干率及總皂苷含量的研究［J］.特產(chǎn)研究，2010，（02）：52-53.

［4］ 趙敏，王炎，康莉.刺五加果實(shí)及種子內(nèi)源萌發(fā)物質(zhì)活性的研究［J］.中國(guó)中藥雜志，2001，26（8）：534-535.

［5］ 鄧勛，宋小雙.九種殺菌劑對(duì)刺五加苗木立枯病菌的室內(nèi)毒力測(cè)定［J］.黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，（10）：54-57.

［6］ 李世東，繆作清，高衛(wèi)東.我國(guó)農(nóng)林園藝作物土傳病害發(fā)生和防治現(xiàn)狀及對(duì)策分析［J］.中國(guó)生物防治學(xué)報(bào)，2011，27（4）：433-440.

［7］ 中國(guó)科學(xué)院微生物所細(xì)菌分類組.一般細(xì)菌常用鑒定方法［M］.北京：科學(xué)出版社，1978.

［8］W.L.Barraquio，L.Revilla，J.K.Ladha.Isolation of endophytic bacteria fromwetland rice［J］.Plant and Soil，1997，（194）：15-24.

Screening of acanthopanax senticosus seedlings endophytic bacteria strains

JIANG Wei1，2，LI Jing1，2，MENG Li-qiang1，2，ZHANG Shu-mei1，2
（1.Institute of Advanced Technology，Heilongjiang Academy of Sciences，Harbin 150020，China；2.Institute of Microbiology，Heilongjiang Academy of Sciences，Harbin 150010，China）

We isolate endophytic bacteria from root，stem and leaf ofacanthopanax senticosus，and the antagonistic effect of biocontrol strains were screened for its blight.48 strains of endophytic bacteria were isolated from the tissues of the acanthopanax senticosus.They belong to bacillus sp.，pseudomonas sp.，xanthomonas sp.and curtobacterium sp.There are four strains of endophytic bacteria antagonistic to rhizoctonia solani ofacanthopanax senticosus，and they have potential for biological control ofacanthopanaxsenticosusdisease.

Acanthopanaxsenticosus；Endophytic bacteria；Antagonistic effect

S567.19

A

1674-8646（2016）16-0008-02

2016-07-09

黑龍江省科學(xué)院青年基金項(xiàng)目

姜威（1986-），女，黑龍江哈爾濱人，碩士，助理研究員，從事微生物藥學(xué)研究。

張淑梅（1969-），女，黑龍江哈爾濱人，博士，研究員，從事微生物藥學(xué)研究，e-mail：shumeizhang@Yhoo.com。