莖點霉真菌Phoma adianticola引起的一種茶樹新病害

楊文，陳瑤，陳小均，姚雍靜，周玉鋒

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莖點霉真菌引起的一種茶樹新病害

楊文1，陳瑤1，陳小均2，姚雍靜1，周玉鋒1*

1. 貴州省農業科學院茶葉研究所，貴州 貴陽 550006；2. 貴州省農業科學院植物保護研究所，貴州 貴陽 550006

對一種引起茶樹芽頭褐變的病原進行了分離鑒定研究。通過柯赫氏法則，成功分離得到了致病菌株。菌株PDA培養條件下的形態學和rDNA-ITS分子鑒定結果表明，此病原菌為莖點霉屬真菌。按照莖點霉屬真菌鑒定程序開展了鑒定研究。此菌在OA和MA培養基上培養7?d后，菌落平均直徑6.0~6.4?cm；分生孢子器圓球形，具孔口，器外壁光滑或有菌絲附著；分生孢子橄欖球形，無隔，多數具2個游球，大小為4.9~6.3?μm×2.1~2.8?μm；NaOH顏色反應呈黃綠色。根據上述特征，初步鑒定此病原菌為。由引起的茶樹芽頭褐變可能是茶樹的一種新病害。根據此菌侵染后的癥狀，暫將其表述為茶樹褐芽病。

莖點霉；；茶樹

近年來，在貴州省湄潭及其周邊茶區大面積發生一種主要為害茶樹夏秋季幼嫩芽葉的病害。此病最初在未展開芽頭基部出現褐色病斑，葉片展開后，葉莖交界處病斑擴大，病斑顏色加深，葉片易脫落，同時又于新的芽頭基部出現褐色病斑；發生嚴重的茶樹枝條后期會鈍縮，以致新芽出芽率低或為畸形芽，明顯降低夏秋茶鮮葉下樹率；感病芽葉采摘后2?h內整芽變黑，嚴重影響茶鮮葉品質，導致茶農減產減收。此病害的田間發病癥狀明顯區別于現有文獻資料所記載的茶樹幼嫩芽葉病害，因而不能對癥制定科學的防治方法。基于上述背景，本研究開展了該病害病原菌的分離與鑒定研究，為制定其預防和控制措施提供理論依據和指導。

1 材料與方法

1.1 田間調查與病葉采集

2013年6月至10月和2014年6月至10月，連續兩年對湄潭茶區發病茶樹進行田間調查（每40?d調查1次），觀察病癥、記載和拍照；并采集典型發病芽頭用于病原分離。

1.2 病原菌分離培養與單孢純化

采用常規組織分離法[1]，取發病茶樹芽頭病健交界處5?mm的組織，用75%的酒精表面消毒1?min，然后用無菌水沖洗3遍，用滅菌濾紙吸干表面的水分，貼于PDA培養基，25℃恒溫光照培養。菌落形成后及時從菌落邊緣挑取菌絲轉接到新的PDA培養基上培養，至菌落中有大量黑色小點即分生孢子器產生。用接種針挑取新鮮的單個分生孢子器置于無菌水滴中，輕輕將分生孢子器輾壓，使分生孢子從中溢出，分布于無菌水中。然后逐步稀釋并鏡檢，直至100倍顯微鏡觀察的1個視野中僅鏡檢到1~2個分生孢子。最后蘸取最終稀釋倍數的分生孢子懸浮液，均勻涂抹在PDA培養基上，培養至單菌落產生，然后用接種針挑取菌絲，移至試管中PDA斜面培養3?d后，置于4℃冰箱內存放備用。

1.3 病原菌回接與再分離

1.3.1 菌絲塊接種

水培茶樹枝條接種，接種20個枝條，在每個枝條芽頭基部接種1塊菌絲塊。取601茶樹品種的健康枝條，長10?cm，經75%酒精表面消毒并用無菌水沖洗干凈，插入含pH值為6.5的霍蘭氏營養液的三角瓶中。取直徑5?mm菌餅接種于茶枝芽頭基部，接種后將三角瓶移入經75%酒精消毒的15?cm高的塑料桶中，塑料桶中加入50?mL無菌水，用保鮮膜覆蓋桶口，置于25℃條件下培養，接種1?d后移去菌絲塊，以無菌PDA塊接種的葉片作對照，移去菌絲塊后觀察葉片發病情況，統計發病率。

1.3.2 分生孢子懸浮液接種

為進一步證實病原菌的致病性，采用1.3.1中水培茶樹枝條接種程序，進行分生孢子懸浮液接種。釆用微型噴霧器，將1.2制好的分生孢子懸浮液均勻噴灑于整個茶樹枝條表面，共接種20個枝條，以噴灑無菌水的茶樹枝條作對照，在1.3.1相同條件下培養。接種后觀察發病情況。

1.3.3 病原菌的再分離

分別對菌絲塊、孢子懸浮液接種后的發病芽頭按1.2的組織分離法進行病原菌再分離，確認前后兩次組織分離法分離所得病原菌在菌絲和孢子形態上是否一致，從而完成柯赫氏法則驗證。

1.4 病原菌的鑒定

1.4.1 病原菌的形態學鑒定

根據Gruyter等[2]和《Identification Manual》[3]一書中的方法，將分離到的菌株接至OA和MA培養基上，置于25℃條件下培養7?d后觀察培養基上的菌落形態特征，光學顯微鏡下觀察菌絲、分生孢子器和孢子形態。

1.4.2 NaOH顏色反應

根據Gruyter等[2]和《Identification Manual》[3]一書中的方法，將供試菌株接種至新鮮的OA和MA平板中央，25℃條件下培養7?d后，在菌落邊緣滴加10?mol·L-1的NaOH溶液，處理后10?min觀察顏色變化情況，直至培養基顏色不變化為止。

1.4.3 病原菌rDNA-ITS分子鑒定

（1）基因組DNA提取

提取病原菌基因組DNA，釆用Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒（購自上海生工）操作。取50?mg新鮮菌絲用于DNA提取，其實驗過程參照Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒操作說明書的程序。

（2）rDNA-ITS擴增

采用真菌ITS通用引物ITS1和ITS4進行擴增。PCR反應體系為25?μL，各組分如下：模板DNA（20~50?ng·μL-1）0.5?μL，10PCR Buffer 2.5?μL，dNTP（10?mmol·L-1）1?μL，引物ITS1和ITS4（10?μmol·L-1）各0.5?μL，DNA聚合酶（5U·μL-1）0.2?μL，ddH2O 19.8?L，所用材料均購自生物工程（股份）有限公司。PCR擴增在PTC-200型擴增儀上完成，程序為94℃預變性4?min，然后94℃ 45?s，55℃退火45?s，72℃延伸1?min，30次循環，72℃延伸10?min，4℃保存。反應結束后取5?μL擴增產物，進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，于凝膠成像系統（Bio-Rad公司）觀察、照相、保存。在紫外燈下從凝膠中切取目的條帶，經SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒純化，送上海生工生物工程技術服務有限公司進行基因測序。

獲得基因序列后，將菌株的rDNA-ITS序列與GenBank數據庫中已知序列進行序列比對并進行同源性分析，結合病原菌的形態學觀察，最終確定病原菌的種類。

2 結果與分析

2.1 田間觀察病害癥狀表現

通過在貴州湄潭對此病進行兩年的田間調查，結果表明，此病于每年6月初開始發生，8月中下旬大面積發生，主要危害茶樹芽頭。此病最初在未展開芽頭基部出現褐色病斑，葉片展開后，葉莖交界處病斑擴大，顏色加深，葉片易脫落，同時又于新的芽頭基部出現褐色病斑（圖1）；發生嚴重的茶樹枝條后期鈍縮，新芽出芽率不高或為畸形芽，以致茶鮮葉絕收，明顯降低夏秋茶鮮葉的下樹率；感病芽葉采摘后2?h內整芽褐變，使其無法出售加工。

2.2 病原菌分離培養與純化

選擇癥狀典型的發病芽頭，釆用組織分離法分離得到病原菌后，通過顯微觀察進行形態鑒定。2013和2014年2年共6次分離結果表明（表1），莖點霉屬真菌分離比例最高，分離率均超過46%，且每次分離的莖點霉屬真菌在菌落、顯微觀察的菌絲和孢子形態均相同；也分離到了部分炭疽病菌，其分離率均不超過19%；其他不產孢且未鑒定的真菌分離率均不超過45%。

2.3 病原菌回接與再分離

通過對上述2年6次分離到的菌株分別進行菌絲塊接種，測定致病性。結果表明，所分離菌均可致病，但只有莖點霉菌株回接后的發病癥狀與田間調查時發病癥狀相似（圖2）。莖點霉菌株菌絲塊接種3?d后均可發病，發病率為100%。孢子懸浮液接種結果表明，接種莖點霉菌株5?d后開始發病，且只有幼嫩芽頭感病，先從芽頭基部出現癥狀，展開的葉片易脫落，其發病情況和田間癥狀一致（圖3）。對以菌絲塊和孢子懸浮液接種發病葉片進行病原再分離，所得菌株培養性狀和形態特征均與接種的菌株相同。基于2年6次的菌絲塊和孢子懸浮液接種結果，確定分離到的莖點霉菌株為病原菌。

2.4 病原菌的鑒定

2.4.1 形態學觀察

（1）菌落特征

在OA培養基上，3?d以前菌絲為白色；第4天可見菌落中央變褐色且菌落表面可見黑色小點，即分生孢子器；培養7?d后，菌絲稀薄，菌落邊緣白色，中央褐色，中央白色氣生菌絲絨氈狀，菌落直徑6.2~6.4?cm（圖4）。在MA培養基上培養7?d后，菌絲稀薄，菌落白色，中央淺褐色，菌落直徑為6.0~6.4?cm（圖5）。在PDA培養基上，3?d以前菌絲為白色，第4天可見菌落中央變褐色，培養7?d后，菌絲稀薄，菌落邊緣白色，中央褐色，可見少量黑色小點，即分生孢子器，菌落直徑6.2~6.5?cm（圖6）。

（2）顯微觀察結果

顯微觀察發現，菌絲分隔，具橋接現象，內具多個圓球形內含物（圖7）。分生孢子器圓球形，具1~2個孔口，器外壁光滑或有菌絲附著，內生分生孢子（圖8）。分生孢子為橄欖球形，無隔，多數具2個游球，分生孢子大小為 (4.9~6.3)?μm×(2.1~2.8)?μm（圖9）。

2.4.2 NaOH反應

菌株在OA和MA培養基上生長7?d后，10?mol·L-1的NaOH溶液處理10?min后，培養基顏色均變為黃綠色，1?h后觀察，仍為黃綠色（圖10）。

2.4.3 rDNA-ITS分子鑒定

用通用引物ITS1和ITS4對菌株的rDNA-ITS區域進行PCR擴增，擴增出517?bp的特異性片斷，產物測序獲得了如圖11所示的序列。

將菌株的rDNA-ITS序列輸入GenBank中進行blast同源性比對，結果（表2）表明，在同源性較高的9個菌株中，鑒定到種的僅有2個（3個登錄號），分別為glomerata和，根據《Identification Manual》[3]一書中對這兩個種相關形態特征的描述，均與供試菌不符合。因而，分子水平的鑒定結果，只能將供試菌株鑒定到莖點霉屬這一級，在種級水平上的鑒定還需參照形態學鑒定結果。

3 討論與結論

本研究對引起貴州湄潭茶葉芽頭褐變的一種真菌進行了分離和鑒定，采用柯赫氏法則分離得到了致病菌株，經形態觀察和rDNA-ITS分子鑒定，確定其為莖點霉屬（）。

莖點霉屬真菌的種類很多，目前全世界報道的超過2?000種；其中多數為植物病原菌。莖點霉屬自Fries創建以來，在其分類和命名方面，Boerema、Gruyter和Noordeloos等人做了大量工作，他們于1992~2003年間，先后在Persoonia和MYCOTAXON兩個期刊發表了20篇主題為《Contributions towards a monograph of(coelomycetes)》的論文，系統地將菌落大小與顏色、厚垣孢子形成、晶體、分生孢子器和分生孢子的特點，產孢細胞形態及類型，NaOH顏色反應，以及該菌的寄主植物等作為該屬真菌不同種間的分類依據。2004年Boerema等[3]又編寫出版了《Identification Manual》一書，該書中詳細記錄了223個種，并編制了其檢索表，該書是目前最為完整和權威的莖點霉屬真菌鑒定手冊。

按照《Identification Manual》一書中的方法，需先將莖點霉屬真菌劃分至九大部分中的一個部分，再鑒定到種。根據分離到的菌株在培養基中產生分生孢子器、未發現厚垣孢子、光滑且有明顯孔口、分生孢子相對較小且無隔的特征，將病原菌劃分至Asect.。

分離到的菌株在OA培養基上培養7?d后，菌落直徑6.2~6.4?cm，在OA和MA培養基上NaOH顏色反應呈陽性，均變為黃綠色，且處理1?h后，仍為黃綠色，根據這些特征，在Gruyter 等[2]發表論文的檢索表中，其檢索結果為。根據分生孢子無隔、其大小為 (4.9~6.3)?μm×(2.1~2.8)?μm，通常含2個油球，同時結合菌落直徑和顏色反應特征，在《Identification Manual》一書的Asect.中檢索結果仍為。分子鑒定過程中，在GenBank核酸數據庫中，與所測菌株同源性高且鑒定到種的為和，但是可以產生豐富的厚垣孢子鏈，且具大量氣生菌絲，在MA培養基上的NaOH顏色反應是由綠色變為紅色，這兩個菌的特征均與供試菌不符。在真菌鑒定研究中，形態學鑒定是基礎，分子鑒定是重要補充[4]，因此，本研究將引起貴州湄潭茶葉芽頭褐變的病原菌初步定為。

現有文獻記錄中，能以茶屬植物為寄主的莖點霉屬真菌主要有Cooke[5-6]、Pass[7-8]、Hara[5,9]、[10]和[11]。根據陸家云[6]的描述，Cooke主要侵染茶的莖部，它明顯區別于本研究病原菌的侵染部位。Pass是芽葉枯病病菌，此病于1970年在我國廣東相關茶園首次發現，可危害茶樹成葉、弱枝、芽葉和嫩梢，芽葉發病時，多數從葉尖或葉緣開始；此菌PDA上的菌絲為淡紅色，明顯區別于本研究病原菌[7-8]。Hara是茶心枯病病原菌，此病多發生在茶樹嫩葉和成葉上，有時芽梢也受害，在嫩葉上先從葉尖開始出現癥狀，在成葉上多從葉片的邊緣開始出現病斑，嫩芽梢受害時，從芽尖開始，逐漸蔓延至半個芽梢枯死，此病原菌較大的分子孢子[大小為 (7~11)?μm×(4~4.5)?μm]區別于本研究中的病原菌[9]。Kinsey[10-11]于2002年描述了和兩個原病菌的寄主包括茶屬植物，但是在OA上的NaOH顏色反應呈陰性[3]，而在OA上培養7?d后的直徑僅為2.0~2.5?cm[3]，兩個菌的相關特征也明顯區別于本研究中的病原菌。

根據《Identification Manual》一書的描述，是一些蕨類植物病害的病原[3]，作為茶屬植物病害病原，未見關于的報道。此外，此病原菌的癥狀表現和相關特征也明顯區別于已有報道和記錄的以茶屬植物為寄主的莖點霉屬真菌。基于此，初步認為，由引起茶樹芽頭褐變的病害可能是茶樹的一種新病害。根據此菌侵染后的癥狀表現，特將此菌引起的茶樹芽頭病害暫表述為茶樹褐芽病。

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[11] Kinsey G C.(Descriptions of Fungi and Bacteria) [J]. IMI descriptions of fungi and bacteria, 2002(151): 1504.

A New Disease of Tea Plant Caused by

YANG Wen1, CHEN Yao1, CHEN Xiaojun2, YAO Yongjing1, ZHOU Yufeng1*

1. Guizhou Tea Research Institute, Guizhou Academy of Agricultural Sciences, Guiyang 550006, China; 2. Guizhou Plant Protection Research Institute, Guizhou Academy of Agricultural Sciences, Guiyang 550006, China

This paper aims to study the pathogen isolation and identification of a kind of disease causing browning on tea buds. The pathogenic strain was obtained according to Koch's Rule. The results of morphological observation of strains and the rDNA ITS molecular identification under the condition of PDA culture showed that the pathogen was a fungus of. The pathogenic strain was further identified in according to the identification procedures of. After 7 days on the OA and MA culture medium, the average diameter of colonies was 6.0-6.4?cm. Pycnidia were globose with 1-2 ostioles, glabrous or with some hyphal outgrowths. Conidia were ellipsoidal, aseptate, usually with two polar guttules, mostly (4.9-6.3)?μm× (2.1-2.8)?μm in size. The NaOH reaction was positive on OA and MA, the colour became yellow-green. The characteristics described above showed that the pathogen was preliminarily identified as. This disease of tea buds caused bymay be a new disease of tea plant. According to the symptoms of infection, this disease was temporarily described as the buds-browning disease of tea.

phoma,, tea plant

S571.1；Q949.32

A

1000-369X（2016）01-059-09

2015-07-02

2015-08-18

貴州省科學技術基金項目（黔科合J字[2014]2101號）、貴州省農業攻關項目（黔科合NZ字[2012]3022號）。

楊文，男，副研究員，博士，主要從事茶樹病蟲害及其防控研究。*通訊作者：gzzhouyf@sohu.com