Spink8基因對EC9706細胞增殖、凋亡及遷移能力的影響*

孫　艷，張　華，封青川，范玉佳，李　濤，張玉超，賀　穎，鄭　紅#

1)鄭州大學基礎醫學院醫學遺傳學與細胞生物學系 鄭州 450001　2)河南省中醫藥大學第一附屬醫院生殖醫學科 鄭州 450003　3)鄭州市婦幼保健院優生科 鄭州 450012

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Spink8基因對EC9706細胞增殖、凋亡及遷移能力的影響*

孫艷1，2)，張華3)，封青川1)，范玉佳1)，李濤1)，張玉超1)，賀穎1)，鄭紅1)#

1)鄭州大學基礎醫學院醫學遺傳學與細胞生物學系 鄭州 4500012)河南省中醫藥大學第一附屬醫院生殖醫學科 鄭州 4500033)鄭州市婦幼保健院優生科 鄭州 450012

Spink8基因；食管癌細胞；增殖；凋亡；細胞遷移

目的：探討Spink8基因對人食管癌EC9706細胞增殖、凋亡及遷移能力的影響。方法：利用DNA重組技術構建Spink8真核表達重組質粒并轉染EC9706細胞，構建穩定表達Spink8的EC9706細胞。取未轉染、轉染空質粒和穩定表達Spink8的EC9706細胞，采用RT-PCR和Western blot 法檢測Spink8 mRNA和蛋白，MTT法檢測細胞增殖，Annexin V-APC/7-AAD法檢測細胞凋亡，并進行Transwell細胞遷移實驗。結果：與未轉染和轉染空質粒組細胞比較，穩定表達Spink8的EC9706細胞增殖受到抑制(P<0.05)，增殖抑制率為24.5%；細胞凋亡率增加(P<0.05)； Transwell小室穿膜細胞數減少(P<0.05)。結論：Spink8可能是一個新的抑癌基因。

食管癌是上消化道中最具有侵略性的惡性腫瘤之一，但其確切的發病機制仍未闡明。Li等[1]運用全基因組陣列分析技術并借助生物信息學篩選可能對食管癌具有重要致病作用的基因和通路，研究結果提示絲氨酸蛋白酶Kazal型抑制劑8(serine protease inhibitor kazal type 8，Spink8)在食管癌組織中表達下調，提示Spink8可能是一個新的抑癌基因，在食管癌的發生發展中起著重要的作用。作者對Spink8基因對人食管癌EC9706細胞的增殖、凋亡及遷移能力的影響進行了探討。

1　材料與方法

1.1主要試劑EC9706由鄭州大學基礎醫學院藥理學教研室惠贈，胎牛血清購自杭州四季青生物工程有限公司，RPMI 1640培養基購自Gibco公司，ReverAidTM第一鏈cDNA 合成試劑盒購于美國Thermo公司，原核表達載體pGEX-5X-3、真核表達載體pEGFP-C1、限制性核酸內切酶(BamHⅠ和EcoRⅠ)、T4連接酶購于TaKaRa公司，Annexin V-APC/7-AAD凋亡檢測試劑盒、質粒小量提取試劑盒、膠回收試劑盒購于Axygen公司。PCR擴增引物由上海生工生物工程技術有限公司合成，兔抗人Spink8多克隆抗體、內參GAPDH單克隆抗體及HRP標記的二抗購自Abcam公司。

1.2穩定表達Spink8的EC9706細胞系的建立

1.2.1原核表達載體的構建Trizol法提取健康人外周血總RNA，按第一鏈 cDNA 合成試劑盒所述步驟以隨機引物反轉錄獲得cDNA。根據GenBank中收錄的人類Spink8基因cDNA序列設計引物，并在上下游引物中分別加入BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位點(F1: 5’-CGCGGATCCCAATGAAGGGGATCTGCT CA-3’；F2:5’-CCGGAATTCTACGTTCAAGAGTTTTCA CATT-3’)。以獲得的cDNA為模板，進行PCR擴增，將原核表達載體pGEX-5X-3及Spink8的PCR產物分別于37 ℃用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切，回收產物經T4連接酶4 ℃過夜連接，然后轉化感受態DH5α，陽性克隆(pGEX-Spink8)經IPTG誘導，觀察GST-Spink8融合蛋白的表達情況，以驗證所調取的基因能否正常表達。

1.2.2真核表達載體的構建以pGEX-Spink8為模板，PCR擴增Spink8編碼框。合成5’端含EcoRⅠ(上游)和BamHⅠ(下游)酶切位點的引物(P1: 5’-CCGGAATTCCACCATGAAGGGGATCTGCTCA-3’;P2:5’-CGCGGATCCCGTTCAAGAGTTTTCACATT-3’)。再將真核表達載體pEGFP-C1和Spink8的PCR產物分別于37 ℃用EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切，回收產物經T4連接酶4 ℃過夜連接，然后轉化感受態DH5α，陽性克隆(pEGFP-Spink8)經雙酶切和測序驗證。

1.2.3細胞培養和轉染EC9706細胞在37 ℃、體積分數5%CO2條件下培養于含體積分數10%已滅活的胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的RPMI 1640培養液中。收獲對數生長期的細胞接種于6孔板，待細胞密度達到80%～90%時，參照Sofast轉染試劑盒操作指南轉染重組質粒pEGFP-Spink8，經G418篩選獲得穩定表達Spink8的EC9706細胞。

1.4細胞增殖抑制率檢測按8 000個/孔將3組細胞分別接種于96孔板，每組設6個復孔。培養24 h后，每孔加20 μL 5 g/L的MTT，避光孵育4 h，棄掉孔內液體，加入DMSO 150 μL平搖5 min，酶標儀測量490 nm波長處各孔的吸光度(A)。細胞增殖抑制率=[(1-實驗組A值)/對照組A值]×100%。以未轉染細胞為對照組。

1.5細胞凋亡檢測根據Annexin V-APC/7-AAD 凋亡檢測試劑盒操作說明處理細胞，上流式細胞儀檢測凋亡率。

1.6細胞遷移實驗分別收集3組細胞并用不含血清和雙抗的培養基調整細胞密度為4×104mL-1，在Transwell小室的下室加入600 μL完全培養基，上室加入200 μL細胞液，常規培養20 h后棄去下室內培養基，無水乙醇固定10 min，1 g/L結晶紫染色10 min,顯微鏡下計數小室上室底膜下室面的細胞數,即穿膜細胞數。

1.7統計學處理采用SPSS 17.0進行數據分析，3組各指標的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2　結果

2.1穩定表達Spink8細胞系的鑒定EC9706細胞內源性Spink8蛋白低表達，轉染pEGFP-Spink8質粒后可以檢測到Spink8 mRNA及蛋白的表達量增加,見圖1、2，提示成功建立了穩定表達Spink8的EC9706細胞系。

2.23組細胞增殖抑制率的比較3組細胞增殖實驗A值比較見表1。穩定表達Spink8細胞組A值較未轉染細胞組明顯降低(P<0.05)。轉染空質粒組與穩定表達Spink8細胞組增殖抑制率分別為9.8%和24.5%。

2.33組細胞凋亡率的比較見表1?？梢姺€定表達Spink8細胞組凋亡率明顯高于其他兩組(P<0.05)。

M:Marker；1、4：未轉染組；2、5：轉染空質粒組；3、6：穩定表達Spink8細胞組；1～3：Spink8；4～6：GAPDH。圖1　3組Spink8 mRNA相對表達情況

1：未轉染組；2：轉染空質粒組；3：穩定表達Spink8細胞組。圖2　3組Western blot 結果

2.43組細胞遷移能力的比較見圖3、表1。穩定表達Spink8細胞組穿膜細胞數明顯低于未轉染組及轉染空質粒組(P<0.05)，而未轉染組與轉染空質粒組相比，差異無統計學意義。

A:未轉染組；B:轉染空質粒組;C:穩定表達Spink8細胞組。圖3　3組Transwell 細胞遷移情況(×200)

表1　3組各指標的比較

*：與未轉染組比較，P<0.05；#：與轉染空質粒組比較，P<0.05。

3　討論

Spink是絲氨酸蛋白酶抑制劑家族最大的一個分支[2]，包含多個亞族，該家族的特征是都含有Kazal結構域。典型的Kazal結構域包含2個α螺旋、3個反向平行β折疊和3對二硫鍵[3]。Spink8基因定位于3p21.3，基因全長27.958 kb，包含5個外顯子，編碼97個氨基酸。

該研究中，作者首先克隆Spink8基因，通過原核表達來檢測所調取的基因能否正常表達。IPTG誘導表達獲得的GST融合蛋白大小約37 000，已知GST標簽蛋白大小為26 000，推測Spink8蛋白相對分子質量大小約11 000，這與用ExPASy軟件預測Spink8蛋白大小一致，表明作者所克隆的Spink8基因可以正常表達，避免了由于基因本身的問題導致后續實驗假陰性結果的產生。

原核表達驗證之后構建真核表達載體pEGFP-Spink8，轉染食管癌EC9706細胞， 使食管癌細胞Spink8基因過表達，構建穩定表達Spink8的EC9706細胞。結果顯示，穩定表達Spink8細胞增殖抑制率較轉染空質粒和未轉染組細胞明顯升高，細胞凋亡率增加，說明提高EC9706細胞內Spink8基因的表達量對細胞增殖具有一定抑制作用，Spink8對EC9706細胞增殖的抑制率為24.5%。目前臨床上廣泛使用的抗腫瘤藥物有5-氟尿嘧啶、紫杉醇、順鉑及阿霉素，它們對細胞的抑制率分別為55.62%、74.44%、77.71%、94.67%[4]。與這些抗腫瘤藥物相比，Spink8對細胞的增殖抑制作用較弱。

Spink家族的諸多成員在人體生理功能、機體炎癥和腫瘤的發生發展中起到重要作用[5-6],其中Spink7已被確定為抑癌基因，其能夠通過uPA/纖溶酶活性來抑制腫瘤細胞的遷移及侵襲[7-8]。該研究結果顯示，Spink8也能夠降低EC9706細胞的遷移能力。此外，Cheng等[9]還發現Spink7參與了中心體的復制以維持染色體的穩定,避免因染色體異常而導致癌癥的發生，該過程依賴于P53通路。單一基因的改變往往不足以影響細胞的凋亡，常常需有多個基因的協同作用共同調節細胞凋亡。因此，對于Spink8的作用機制還應該與其他腫瘤相關基因一起研究。

總之，作者從細胞水平探究了Spink8對EC9706細胞的作用，Spink8過表達可以在一定程度上抑制食管癌EC9706細胞的增殖及遷移，并促進其凋亡，可能是一個新的抑癌基因。但是，該研究還停留在細胞水平，尚需進行蛋白表達層面及相關分子機制的研究，以為腫瘤的預防、早期診斷和預后判斷提供理論基礎和新的途徑。

[1]LI JD，FENG QC,LI JS.Differential gene expression profiling of oesophageal squamous cell carcinoma by DNA microarray and bioinformatics analysis[J].J Int Med Res,2010,38(6):1904

[2]OU CM,TANG JB,HUANG MS,et al.The mode of reproductive-derived Spink(serine protease inhibitor Kazal-type) action in the modulation of mammalian sperm activity[J].Int J Androl,2012,35(1):52

[3]WAPENAAR MC,MONSUUR AJ,POELL J,et al.The SPINK gene family and celiac disease susceptibility[J].Immunogenetics,2007,59(5):349

[4]黃銀久,宋寶安,金林紅,等.MTT比色法抗腫瘤藥物篩選實驗條件和數據優化探索[J].激光生物學報,2009,18(3):401

[5]J?ERGENSEN MT,BRUSGAARD K,NOVOVIC S,et al.Is the SPINK1 variant p.N34S overrepresented in patients with acute pancreatitis? [J].Eur J Gastroenterol Hepatol,2012,24(3):309

[6]ROCKETT JC,PATRIZIO P,SCHMID JE,et al.Gene expression patterns associated with infertility in humans and rodent models[J].Mutat Res,2004,549(1/2):225

[7]CHENG X,LU SH,CUI Y. ECRG2 regulates ECM degradation and uPAR/FPRL1 pathway contributing cell invasion/migration[J]. Cancer Lett,2010,290(1): 87

[8]TANG CH,WEI Y.The urokinase receptor and integrins in cancer progression[J].Cell Mol Life Sci,2008,65(12):1916

[9]CHENG X,SHEN Z,YANG J,et al.ECRG2 disruption leads to centrosome amplification and spindle checkpoint defects contributing chromosome instability[J].J Biol Chem,2008,283(9):5888

(2015-11-05收稿責任編輯王曼)

Effects of Spink8 gene on proliferation,apoptosis and migration of EC9706 cells

SUNYan1，2),ZHANGHua3),FENGQingchuan1),FANYujia1),LITao1),ZHANGYuchao1),HEYing1),ZHENGHong1)

1)DepartmentofMedicalGeneticsandCellBiology,CollegeofBasicMedicalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500012)DepartmentofReproductiveMedicine,theFirstAffiliatedHospital,HenanUniversityofTraditionalChineseMedicine,Zhengzhou4500033)PrepotencyDivision,WomenandInfantsHospitalofZhengzhou,Zhengzhou450012

Spink8 gene；esophageal cancer cell；proliferation；apoptosis；cell migration

Aim: To investigate the effects of Spink8 gene on proliferation, apoptosis and migration of human esophageal cancer cell EC9706. Methods: Eukaryotic expression plasmid pEGFP-Spink8 was established by DNA recombination in vitro, and transfected into EC9706 cells. The expressions of Spink8 mRNA and protein were examined by RT-PCR and Western blot. MTT method was used to detect cell proliferation, Annexin V-APC/7-AAD method was used to detect cell apoptosis, and migration ability was detected by Transwell assay. Results: The plasmid of pEGFP-Spink8 was successfully established. Compared with the EC9706 cells without transfection or transfected with null plasmid, the number of surviving cells transfected with pEGFP-Spink8 decreased(P<0.05), and proliferation inhibition rate was 24.5%; the apoptosis rate was significantly increased(P<0.05); the number of cells which passed Transwell chamber decreased(P<0.05). Conclusion: Spink8 may be a new tumor suppressor gene.

10.13705/j.issn.1671-6825.2016.05.003

，女，1966年3月生，博士，教授，研究方向：遺傳性疾病的致病基因的篩選與研究，E-mail:hzheng@zzu.edu.cn

*河南省醫學科技攻關計劃201303001

R735.1