人腦膠質瘤組織中CPEB4的表達及與細胞遷移和侵襲的關系*

劉志軍，周海存，陳小兵，劉紅林#，王貴聰

1)河南大學淮河醫院神經外科 開封 475500　2)永城市人民醫院急診科 商丘 476600

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人腦膠質瘤組織中CPEB4的表達及與細胞遷移和侵襲的關系*

劉志軍1)，周海存2)，陳小兵1)，劉紅林1)#，王貴聰1)

1)河南大學淮河醫院神經外科 開封 4755002)永城市人民醫院急診科 商丘 476600

CPEB4；膠質瘤；侵襲；遷移

目的：探討CPEB4在人腦膠質瘤組織中的表達及其與細胞遷移和侵襲能力的關系。方法：收集30例人腦膠質瘤患者的新鮮膠質瘤組織和瘤旁正常組織標本，應用Western blot法檢測CPEB4的表達；分析CPEB4表達與患者臨床病理特征的關系；分別應用siRNA基因干擾系統和質粒過表達系統下調和上調人腦膠質瘤細胞SKMG-4和T98中CPEB4表達；應用Transwell實驗檢測細胞的侵襲和遷移能力；應用Western blot檢測差異表達CPEB4后MMP2和MMP9的表達。結果：30例患者中，22例患者的膠質瘤組織中CPEB4表達高于瘤旁正常組織；CPEB4在腦膠質瘤組織中的高表達與KPS評分和病理分級有關(P<0.05)；下調SKMG-4細胞CPEB4表達后，siCPEB4#2組遷移細胞數和侵襲細胞數均高于siControl組(P<0.001)，且MMP2和MMP9表達降低；上調T98細胞CPEB4表達后，CPEB4過表達組遷移細胞數和侵襲細胞數均低于對照組(P<0.05)，且MMP2和MMP9表達增高。結論：CPEB4在腦膠質瘤組織中呈高表達；CPEB4可通過調控MMP2和MMP9表達影響腦膠質瘤細胞的侵襲和遷移能力。

腦膠質瘤是中樞神經系統常見的原發惡性腫瘤之一[1]。腦膠質瘤常呈浸潤性生長，可累及重要的神經結構，且與正常腦組織無明確界限，以至于腫瘤難以徹底切除并較容易復發。胞質多聚腺苷酸化元件結合蛋白4(cytoplasmic polyadenylation element-binding protein 4，CPEB4)是具有序列特異性的RNA結合蛋白，在信使RNA的翻譯過程中起著重要的調控作用。近年來研究[2]發現，CPEB4在胰腺癌組織中呈高表達，且與腫瘤的發生發展有關。該研究中，作者應用Western blot和qRT-PCR法檢測CPEB4在人腦膠質瘤和正常腦組織中的表達情況，并分析其表達與腫瘤侵襲和轉移的關系。

1　材料與方法

1.1組織標本收集30例在河南大學淮河醫院神經外科診治的腦膠質瘤患者的新鮮組織標本，包括膠質瘤原發灶和瘤旁正常腦組織，儲存于-80 ℃超低溫冰箱中備用。患者均簽署知情同意書。其中年齡≤55歲22例，>55歲8例；男8例，女22例；KPS評分≤80分者13例，>80分者17例；腫瘤直徑≤3 cm者15例，>3 cm者15例；WHO病理分級Ⅰ級8例，Ⅱ級9例，Ⅲ級6例，Ⅳ級7例。

1.2主要材料 鼠抗人CPEB4單克隆抗體購于美國Abcam公司，兔抗人MMP2、MMP9和GAPDH抗體購于武漢三鷹生物科技公司。 Transwell小室購于南京凱基生物科技公司。Matrigel生物膠購于美國Sigma公司。RNA提取和qRT-PCR檢測試劑購于日本TaKaRa公司。轉染試劑Lipo-2000購于美國Invitrogen公司。CPEB4過表達質粒購于上海和元生物科技公司，siRNA購于廣州銳博生物科技公司。

1.3人腦膠質瘤和正常腦組織、細胞中CPEB4表達的Western blot檢測應用蛋白裂解液提取組織或細胞蛋白；應用BCA法檢測蛋白濃度后進行配平以保證蛋白濃度一致；應用蛋白干煮器在95 ℃靜置7 min，使蛋白變性；配制電泳液和轉膜液，以電壓80 V行電泳2 h；應用濕轉法將蛋白轉至PVDF膜上；轉膜后應用50 g/L脫脂奶液進行封閉1 h；封閉后將相關條帶置入抗體稀釋液中，4 ℃孵育24 h；回收抗體后，將條帶置入TBST洗膜液中洗膜3次，每次5 min；二抗孵育1～2 h；TBST洗膜3次，每次5 min；配制ECL發光液，應用Image曝光儀進行曝光顯影。根據曝光強度評判CPEB4蛋白表達情況，將CPEB4在腦膠質瘤組織中表達高于正常組織的病例歸為高表達組，將CPEB4在腦膠質瘤組織中表達低于正常組織的病例歸為低表達組。

1.4過表達質粒和siRNA轉染選取腦膠質瘤細胞SKMG-4和T98進行細胞實驗，應用siCPEB4#1、siCPEB4#2、siCPEB4#3和siControl序列干預細胞篩選轉染條件。SKMG-4細胞設siControl組和siCPEB4#2組，T98細胞設pcDNA3.1-Control組和pcDNA3.1-CPEB4組。預先將6孔板中培養基棄去，PBS洗2～3次，加入1.5 mL Opti-MEM培養基；配制A溶液：0.25 mL/孔Opti-MEM培養基+5 μL/孔Lipo-2000試劑，靜置5 min；配制B溶液：0.25 mL/孔Opti-MEM培養基+pcDNA3.1-Control質粒或pcDNA3.1-CPEB4質粒1.0 μg/孔或siRNA 5 nmol/孔，靜置5 min；混合A液和B液，靜置20 min；按0.5 mL/孔AB混合液加入6孔板中，置入培養箱中4～6 h后更換為FBS。常規轉染48 h后收集細胞進行相關實驗。

1.5細胞遷移實驗取膠質瘤細胞培養至70%～80%融合，胰蛋白酶消化后1 000 r/min離心，棄上清，體積分數1% FBS重懸細胞，充分吹打后進行細胞計數；按5萬個/孔、200 μL/孔配制細胞懸液。于24孔板里加入700 μL含體積分數10% FBS的培養基后，架上Transwell小室，將細胞種植于小室上層(無需鋪置Matrigel)，注意不要產生氣泡；細胞培養箱中培養16 h；取出培養板，向下室中加入1 mL多聚甲醛，將小室置于其中固定15 min；加入1 mL結晶紫，室溫下15 min；自來水洗3遍；風干，注意避光；倒置顯微鏡下觀察，選取5個視野進行計數。每組3個復孔。

1.6細胞侵襲實驗取出凍存于-20 ℃的Matrigel生物膠，在4 ℃冰箱中過夜融化，置于冰盒中于超凈臺外備用；取Matrigel生物膠100 μL與預冷的RPMI 1640 400 μL，在EP管(1.5 mL)中充分混勻。向每個小室中加入40 μL，防止產生氣泡，然后將Transwell板放入細胞培養箱中4 h使Matrigel聚集成膠。 其他步驟同1.5。

1.7統計學處理采用SPSS 18.0進行數據分析。人腦膠質瘤組織中CPEB4表達情況與臨床病理特征的關系采用χ2檢驗或精確概率法進行分析，2組間細胞穿透數的比較采用兩獨立樣本的t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2　結果

2.1人腦膠質瘤和正常腦組織中CPEB4蛋白的表達Western blot結果見圖1。CPEB4蛋白在73.33%(22/30)的膠質瘤組織中呈高表達。

N:正常腦組織；T：腦膠質瘤組織。圖1　人腦膠質瘤和正常腦組織中CPEB4蛋白的表達

2.2人腦膠質瘤組織中CPEB4表達與臨床病理特征的關系結果見表1。由表1可知，腦膠質瘤組織中CPEB4的表達與KPS評分和病理分級有關，而與年齡、性別和腫瘤直徑無關。

表1　CPEB4表達與腦膠質瘤患者臨床病理特征的關系　例

*:精確概率法。

2.3下調CPEB4表達抑制膠質瘤細胞SKMG-4遷移和侵襲能力Western blot檢測結果顯示，CPEB4在SKMG-4膠質瘤細胞中呈高表達，而在T98細胞中表達程度較低(圖2A)。應用siCPEB4和siControl序列干預細胞后發現，3條siRNA序列均可有效下調CPEB4表達(圖2B)，因此應用siCPEB4#2進行后續研究。Western blot結果顯示，下調CPEB4后MMP2和MMP9表達降低(圖2C)。細胞遷移和細胞侵襲實驗結果見表2。

A：CPEB4在腦膠質瘤細胞SKMG-4和T98中的表達；B:siRNA下調SKMG-4細胞中CPEB4的表達；C：下調CPEB4表達后對MMP9和MMP2蛋白表達的影響。圖2　各組SKMG-4細胞中CPEB4蛋白的表達

表2　下調膠質瘤細胞SKMG-4CPEB4的表達對細胞遷移和侵襲能力的影響

2.4上調CPEB4表達促進膠質瘤細胞T98遷移和侵襲能力應用CPEB4過表達質粒上調膠質瘤細胞T98中CPEB4表達后，應用Western blot法檢測CPEB4蛋白，結果見圖3A。Western blot檢測結果顯示，上調CPEB4后MMP2和MMP9表達增高(圖3B)。細胞遷移和細胞侵襲實驗結果見表3。

A：過表達質粒上調T98細胞中CPEB4的表達；B：過表達質粒上調CPEB4表達后對MMP9和MMP2蛋白表達的影響。圖3　各組T98細胞中CPEB4蛋白的表達

表3　上調膠質瘤細胞T98CPEB4的表達對細胞遷移和侵襲能力的影響

3　討論

腦膠質瘤是最常見的中樞神經系統惡性腫瘤，占所有神經系統腫瘤的30%，占所有惡性腦腫瘤的80%[3]。CPEB4與腫瘤發生發展有關。近年來研究[4-9]發現，CPEB4在多種惡性腫瘤組織中呈高表達，且與腫瘤的侵襲和轉移等生物學功能有一定的相關性。CPEB4在膠質瘤組織中呈高表達，隨著病理分級的增高，CPEB4的表達逐漸增高；且CPEB4在膠質瘤組織中的高表達提示膠質瘤患者的預后較差[10-11]。作者發現，CPEB4在腦膠質瘤組織中的高表達提示患者有更高的KPS評分和更差的病理分級。

在針對腦星形細胞瘤的研究[8]中發現，下調CPEB4表達可明顯抑制細胞的增殖、侵襲和遷移能力，其機制可能是抑制腫瘤細胞上皮間質轉化。此外，在結腸癌和肝癌的研究[6,11]中發現，CPEB4可受到miR-203和miR-550a的直接調控，進而影響腫瘤的增殖、凋亡、周期、侵襲和轉移等。該研究結果提示在腦膠質瘤組織中，CPEB4呈現較為明顯的高表達。當應用siRNA下調SKMG-4膠質瘤細胞中CPEB4的表達后，細胞侵襲和遷移實驗中的穿透細胞數較對照降低，MMP2和MMP9表達降低；而上調T98細胞中CPEB4表達后，穿透細胞數增多，MMP2和MMP9表達增高；其結果提示CPEB4可通過影響MMP2和MMP9等的表達影響膠質瘤細胞的侵襲和轉移能力。 在慢性肝炎的研究[12]中發現，細胞中存在CPEB4自我增益的級聯反應環路。因此，對CPEB進行深入研究，有助于針對慢性肝炎或惡性腫瘤等疾病的新靶向藥物的開發。該課題組將在后續研究中探討CPEB4是否在膠質瘤中也存在相似的機制。

綜上所述，CPEB4在膠質瘤組織中呈明顯的高表達；且其高表達可促進膠質瘤細胞的侵襲和轉移，而低表達可抑制細胞的轉移，其機制可能是影響MMP2和MMP9的表達。

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(2016-03-15收稿責任編輯姜春霞)

Expression of CPEB4 in human brain glioma tissue and its relationship with cell invasion and migration

LIUZhijun1),ZHOUHaicun2),CHENXiaobing1),LIUHonglin1),WANGGuicong1)

1)DepartmentofNeurosurgery,HuaiheHospital,HenanUniversity,Kaifeng4755002)DepartmentofEmergency,YongchengPeople′sHospital,Shangqiu476600

CPEB4;glioma;invasion;migration

Aim: To explore the expression of CPEB4 in human brain glioma tissue and its relationship with cell invasion and migration.Methods: A total of 30 paired fresh tissue were obtained from the resection specimens of glioma patients. The expression of CPEB4 in tumor and adjacent normal tissue was detected by Western blot. CPEB4 expression was upregulated and downregulated by overexpressing plasmid and siRNA in glioma cell lines SKMG-4 and T98. The cell invasion and migration was detected by Transwell assay.MMP2 and MMP9 expressions were detected by Western blot. Results: The expression of CPEB4 was higher in 22 cases of tumor tissue than that in adjacent normal brain tissue. CPEB4 expression was related with pathological grade and KPS score(P<0.05).When downregulating CPEB4 expression in SKMG-4 cells by siRNA, pierced cells in siCPEB4#2 group were significantly less than those in siControl group(P<0.001), and the expressions of MMP2 and MMP9 were also reduced. When upregulating CPEB4 expression in T98 cells by pcDNA-3.1 plasmid, pierced cells in control group were significantly more than those in pcDNA-3.1-CPEB4 group(P<0.05), and the expressions of MMP2 and MMP9 were also increased. Conclusion: The expression of CPEB4 is higher in brain glioma tissue. CPEB4 could regulate glioma cell invasion and migration ability by regulating the expression of MMP2 and MMP9.

10.13705/j.issn.1671-6825.2016.05.017

*河南省科技發展計劃項目162102310162

，男，1972年10月生，碩士，副主任醫師，研究方向：神經系統腫瘤，E-mail：13592116850@139.com

R730.264