KLF7聯合脂肪源性干細胞對小鼠坐骨神經缺損后軸突再生的影響

李文媛，王　瑩，李智剛，閆　哲，楊春壯，李凱軍，趙　微

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KLF7聯合脂肪源性干細胞對小鼠坐骨神經缺損后軸突再生的影響

李文媛1，王瑩1，李智剛2，閆哲1，楊春壯1，李凱軍1，趙微1

目的探討核轉錄因子KLF7與脂肪源性干細胞(ADSC)聯合應用對小鼠脫細胞同種異體神經支架(ANA)移植坐骨神經缺損后軸突再生和功能恢復的影響。方法成年C57BL/6小鼠隨機分為脫細胞神經支架(ANA)組、ADSC組和KLF7+ADSC組，每組10只。坐骨神經功能指數(SFI)和電生理方法檢測神經運動功能的恢復，Western bolt檢測神經移植體內KLF7、TrkA和TrkB的蛋白表達。NF200免疫熒光法檢測神經支架中軸突再生，并示蹤PKH26標記的移植ADSC。結果與ADSC組比較，KLF7+ADSC組神經移植體內KLF7、TrkA和TrkB蛋白表達明顯增高，NF200表達增強，PKH-26標記的ADSC數量顯著增高(P<0.05)。與ANA組比較，ADSC組和KLF7+ADSC組電生理波幅增高、神經傳導速度增快、延遲期縮短，SFI功能指數增高，其中KLF7+ADSC組神經恢復作用顯著優于ADSC組(P<0.05)。結論KLF7聯合ADSC移植對小鼠ANA修復坐骨神經缺損后軸突再生和功能恢復的作用優于ADSC組，其機制可能與KLF7高表達促進神經移植體內TrkA和TrkB表達，進而促進移植的ADSC存活有關。

KLF7；脂肪源性干細胞；脫細胞異體神經；TrkA；TrkB

由各種原因所導致的周圍神經損傷為臨床常見病，嚴重影響著人類的健康。近年來發現轉錄因子為中樞神經系統損傷后許多病理生理改變提供廣泛的神經保護和治療作用[1]。其中核轉錄因子KLF7(Krüppel-like Factor 7，KLF7)能夠調控多種細胞的發育、增殖和分化[2]。KLF7基因敲除可導致中樞神經、視網膜和嗅覺神經損傷后軸突再生障礙[3，4]，轉錄激活KLF7能夠促進成人的皮質脊髓束軸突再生[5]。有研究表明KLF7還能夠顯著促進神經營養因子高親和力受體酪氨酸激酶受體A(Tyrosine Kinase Receptor A，TrkA)和酪氨酸激酶受體B(Tyrosine Kinase Receptor B，TrkB)等表達[6]，但其在周圍神經再生的作用及其機制報道較少。

我們前期研究[7]已證實同種異體脫細胞異體神經(acellular nerve allograft，ANA)能夠有效橋接坐骨神經缺損，但單獨使用ANA運動功能恢復效果并不理想。本研究擬將脂肪源性干細胞(Adipose-derived stem cell，ADSC)作為種子細胞植入ANA橋接坐骨神經缺損，并聯合腺相關病毒2(adeno-associated virus 2，AAV2)介導將KLF7基因轉染至ANA治療，探討KLF7聯合ADSC對坐骨神經缺損后軸突再生和功能恢復的影響，為坐骨神經損傷提供新的治療方法。

1　材料和方法

1.1細胞培養參照前期研究方法[8]取小鼠腹部脂肪組織進行ADSC細胞分離、培養及傳代，2 w后茜草素紅染色鑒定ADSC向成骨誘導的細胞，經細胞鑒定后取第4代ADSC行PKH26(Sigma公司，美國)染色標記[7]，進行體內移植實驗。

1.2動物模型30只6～8 w C57BL/6小鼠(雄性15 只，雌性15 只)，由中國醫科大學實驗動物中心提供，體質量18～22 g，按體質量隨機分為：(1)ANA組：采用化學萃取脫細胞方法[7，8]制備CD1小鼠ANA，注入100 μl PBS于ANA，橋接長5 mm坐骨神經兩斷端間的缺損，n=10；(2)ADSC組：注入等劑量ADSC(1×106個/100 μl)于ANA橋接坐骨神經缺損，n=10；(3)KLF7+ADSC組：同ADSC組方法進行ANA橋接后，ANA給予微量注射器注射2 μl AAV2-KLF7(1×1011病毒顆粒，Vector BioLabs公司，美國)，n=10。3組術后28 d麻醉取材。

1.3坐骨神經功能指數(Sciatic functional index，SFI)參照前期研究方法行SFI檢測[6]，術后28 d，制備一個塑料通道(8.5 cm寬，50 cm長)，底部放置一張70 g白紙，黑色墨水蘸在小鼠雙側后足從通道一端行走至另一端，每個后足印在紙面3～4個足印，檢測足趾寬度(TS)、足趾長度(PL)及中間足趾寬度(ITS)。SFI=-38.3[(EPL-NPL)/NPL]+109.5[(ETS-NTS)/NTS]+13.3[(EIT-NIT)/NIT]-8.8。

1.4電生理檢測采用經顱磁刺激MEP(transcranial magnetic motor-evoked potentials，tcMMEP)方法[1]，應用Magstim Model 200 磁刺激器(Magstim 公司，英國)和誘發電位儀(NIHON KOHDEN公司，日本)經顱磁刺激運動誘發電位觀察小鼠坐骨神經損傷后發生神經傳導潛伏期、傳導速度及波幅改變，將電磁線圈置于顱骨激活皮質下組織誘發tcMMEP反應，探查電極置于腓腸肌肌腹，參考電極插入肌腱，接地電極插入尾巴。每只小鼠每側均檢測3次，每次間隔1 min，結果取平均值。

1.5Western blotting檢測術后28 d，小鼠麻醉取ANA沖洗，剝離硬膜放置干冰保存，電泳分離蛋白樣品(20 μg)后轉膜、封閉，加入一抗：兔抗KLF7抗體(1∶200，sigma公司，美國)、兔抗TrkA抗體(1∶200，sigma公司，美國)和兔抗TrkB抗體(1∶200，sigma公司，美國)，4 ℃過夜，辣根過氧化物酶標記種屬特異性二抗(1∶5000)孵育1 h，使用增強化學發光檢測系統(GE Healthcare公司，英國)觀察蛋白印跡。

1.6免疫熒光組化染色將快速分離的ANA置于含4%多聚甲醛固定，30%蔗糖脫水，冰凍切片，常規免疫組化染色，一抗為兔抗NF200(1∶200，sigma公司，美國)，二抗為羊抗兔FITC(1∶200，sigma公司，美國)，熒光顯微鏡下觀察并同時示蹤PKH26標記的ADSC。每張切片400倍鏡下隨機選取4個視野檢測光密度(IOD)值。

2　結　果

2.1ADSC培養與分化原代培養ADSC 8 d后形成的細胞群落較為密集，ADSC呈多角形或梭形伸展，有鋪路石狀特征。ADSC分化誘導成骨28 d后，可見分化細胞內的鈣沉積茜素紅染色 (見圖1)。

2.2Western bolt結果KLF7+ADSC組和ADSC組ANA中TrkA和TrkB蛋白表達較ANA組顯著增高，其中聯合組TrkA和TrkB蛋白表達高于ADSC對照組。ANA組和ADSC組KLF7蛋白表達極少，而KLF7+ADSC組KLF7表達顯著增高(KLF7：F2，12=125.9，P<0.001；TrkA：F2，12=85.15，P<0.001；TrkB：F2，12=77.10，P<0.001)(見圖2)。

2.3免疫熒光染色觀察熒光顯微鏡下可見KLF7+ADSC組和ADSC組在ANA中段有PKH26標記的ADSC，而KLF7+ADSC組PKH26陽性表達顯著高于ADSC組 (t=3.56，P<0.05)。免疫熒光法染色NF200檢測神經支架中段軸突生成情況，與ADSC組比較，KLF7+ADSC組NF200表達顯著增加(t=21.75，P<0.001)(見圖3)。

2.4SFI檢測結果術后28 d，與ANA組比較，ADSC組和KLF7+ADSC組SFI指數顯著增高，其中KLF7+ADSC組SFI指數高于ADSC組(F2，27=27.82，P<0.001)(見圖4)。

2.5神經電生理檢測與ANA組比較，ADSC組和KLF7+ADSC組神經傳導速度及波幅顯著增加，而延遲期縮短，其中聯合組改善神經電生理參數優于ADSC組 (神經傳導速度：F2，12=57.11，P<0.05；延遲期：F2，12=19.24，P<0.05；波幅：F2，12=22.76，P<0.05)(見表1)。

表1　各組神經電生理參數檢測

*與ANA組比較P<0.05；#與ADSC組比較P<0.05

圖1A：原代培養ADSC 8 d后呈鋪路石狀；B：ADSC分化誘導成骨，細胞內的鈣沉積茜素紅染色

圖2Western bolt實驗檢測各組再生神經中KLF7、TrkA和TrkB 蛋白相對表達*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

圖3術后4 w ADSC組和KLF7+ADSC組神經移植體中段PKH26和NF200免疫組化熒光染色(A)，PKH26和NF200的IOD值(B)，標尺=100 μm，n=10

圖4坐骨神經功能指數實驗(n=10)，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

3　討　論

目前發現近端周圍神經病變或完全橫斷的預后普遍較差，運動功能恢復緩慢。其中主要原因是適宜神經生長的微環境缺乏，軸突生長底物和神經營養因子減少及受損軸突內在生長速度太慢，導致再生軸突需較長時間連接遠端失神經支配的神經、不能重新支配靶組織，其功能恢復并不理想[9]。

我們前期研究發現[7，8]ANA由于脫去了周圍神經的細胞成分，保存了神經天然結構，具有較好的組織相容性，能夠為神經缺損提供良好的神經生長微環境。而種子細胞ADSC可合成和分泌大量神經營養因子，如神經生長因子、血管內皮生長因子等，這些促進神經生長的因子表達變化提供軸突生長的營養。本研究電生理檢測結果也再次證實ADSC能夠促進ANA橋接神經缺損后功能恢復，但SFI指數結果表明ADSC組神經功能恢復效果并不盡如人意，盡管其SFI指數有增高趨勢，大量研究證實[10～13]聯合治療能夠克服多種抑制神經軸突再生的因素，較單一治療效果更為明顯。

Krüppel like Factor(KLF)家族[14]是一類具有鋅指結構的轉錄因子家族，其典型結構特征是在其羧基端具有3個C2H2鋅指結構。KLF家族廣泛參與細胞增殖、凋亡、分化以及胚胎發育等多個生命活動的調控。其中，核轉錄因子KLF7[2～4]在中樞和周圍神經系統中廣泛存在，其結構與其家族一樣，含有一個DNA結合結構域和一個激活結構域，其DNA結合結構域位于C末端，通過羧基端三個連續鋅指構成的保守結構域結合靶基因啟動子內富含GC序列以調控其轉錄。近幾年研究表明[4～6]KLF7調控多種細胞的發育、增殖和分化，對中樞神經系統軸突再生、髓鞘形成和神經膠質細胞的分化發揮重要作用。本研究結果證實術后4 w與ADSC組比較，聯合組KLF7、TrkA和TrkB蛋白在神經支架內表達顯著增高，證實KLF7高表達能夠有效激活TrkA和TrkB細胞信號通路，這與以往研究結果相一致[6]。

另外本研究還發現聯合組ANA中段PKH26標記陽性細胞個數顯著高于ADSC組，而且NF200標記的軸突數量也顯著高于ADSC組，因此我們推測KLF7可能通過激活TrkA和TrkB細胞信號通路，TrkA和TrkB是神經營養因子的高親和力受體，通過與腦源性神經營養因子或神經生長因子特異性配體結合[15]，促進移植的ADSC增殖和存活，進而促進軸突的再生。研究還發現與ANA組相比，ADSC組和KLF7+ADSC組顯著改善電生理參數，說明ADSC組和聯合組均能夠促進坐骨神經損傷后功能恢復，但KLF7聯合ADSC治療效果明顯優于ADSC組，其SFI指數也高于ANA組和ADSC組，證實了KLF7聯合ADSC能夠協同促進神經功能恢復。

綜上所述，本研究探討聯合應用KLF7和ADSC治療坐骨神經缺損，證實了聯合治療能夠促進小鼠ANA移植后軸突再生和功能恢復，其機制可能與KLF7激活TrkA和TrkB細胞信號通路，促進移植的ADSC的存活有關。

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Effects of KLF7 and ADSC transplantation on expression of BDNF and its receptor TrkB after sciatic nerve injury in mice

LIWenyuan，WANGYing，LIZhigang，etal.

(DepartmentofAnatomy，MudanjiangMedicalCollege，Mudanjiang157011，China)

ObjectiveTo study the effect of KLF7 and adipose-derived stem cell (ADSC) transplantation on expression of axonal regeneration and function recovery after acellular nerve allograft (ANA)repair of the sciatic nerve gap in mice. MethodsAdult C57BL/6 mice were randomly divided into ANA group，ADSC group and KLF7+ADSC group. The sciatic functions index (SFI) and electrophysiology were used to evaluate functional recovery. KLF7，TrkA and TrkB protein were evaluated by Western bolt，the protein expression of NF200 and the fluorescence signal of ADSC labeled with PKH-26 in the nerve graft was observed by using immunofluorescence. ResultsCompared with ANA group，the expression of KLF7，TrkA，TrkB，NF200 and PKH-26 labeled ADSC in KLF7+ADSC group were increased (P<0.05). Compared with ANA group，nerve conduction velocity，wave amplitude and the SFI score were significantly increased in ADSC group and KLF7+ADSC group (P<0.05)，however，incubation period were significantly decreased in two treatment groups (P<0.05)，and the effect of KLF7+ADSC group was more powerful than ADSC group (P<0.05). ConclusionThe combined KLF7 and ADSC transplantation treatment promoted axon regeneration and function recovery much significantly than ADSC treatment，which may be related to KLF7 upregulating TrkA and TrkB expression in the ANA，and promoting ADSC survival.

KLF7；Adipose-derived stem cell；Acellular nerve allograft；TrkA；TrkB

1003-2754(2016)07-0580-04

2016-01-15；

2016-04-16

國家自然科學基金(No. 81371362)；黑龍江省自然科學基金項目(No. H201491)；黑龍江省衛生計生委立項科研課題(No. 2014-211)；牡丹江醫學院科學技術研究項目(No. 2s201310)

(1.牡丹江醫學院解剖學教研室，黑龍江 牡丹江 157011；2.牡丹江醫學院紅旗醫院普外科，黑龍江 牡丹江 157011)

王瑩，E-mail：yingwang770224@163.com

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