局灶性腦缺血大鼠紋狀體區(qū)域Shh信號通路成分的表達(dá)變化及對髓鞘修復(fù)的影響

趙　紅，吳曉君，劉贊華，王蘇平，閆　旭

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局灶性腦缺血大鼠紋狀體區(qū)域Shh信號通路成分的表達(dá)變化及對髓鞘修復(fù)的影響

趙紅1，吳曉君2，劉贊華1，王蘇平1，閆旭2

目的檢測Sonic Hedgehog (Shh)信號通路及其轉(zhuǎn)錄因子Gli1在局灶性腦缺血后不同時間點的表達(dá)變化，探討該通路對腦缺血后髓鞘再生的影響。方法線栓法建立大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型，使用免疫組化和RT-PCR的方法觀察腦缺血后1 d，3 d，7 d和14 d Shh，Gli1的表達(dá)變化。堿性髓鞘蛋白(myelin basic protein，MBP)是髓鞘的組成成分，用作髓鞘的標(biāo)志物，觀察腦缺血后上述各時間點MBP的表達(dá)變化。結(jié)果正常大鼠Shh和Gli1廣泛分布于腦白質(zhì)和灰質(zhì)，如皮質(zhì)，胼胝體和紋狀體等區(qū)域。Shh和Gli1的表達(dá)在腦缺血后3 d～14 d呈逐漸上升趨勢。MBP的表達(dá)在腦缺血后1 d～28 d逐漸下降。結(jié)論腦缺血性損傷可激活Shh信號通路，激活的Shh可能通過調(diào)控細(xì)胞的增殖參與神經(jīng)修復(fù)，針對Shh的表達(dá)量進(jìn)行干預(yù)治療將為脫髓鞘疾病的治療提供理論依據(jù)。

局灶性腦缺血；Shh信號通路；Gli1；髓鞘再生

白質(zhì)損傷越來越受到人們的關(guān)注。軸突、少突膠質(zhì)細(xì)胞及由少突膠質(zhì)細(xì)胞形成的髓鞘是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nerve system，CNS)白質(zhì)的重要成份。與神經(jīng)元類似，少突膠質(zhì)細(xì)胞對于損傷也極為敏感，導(dǎo)致髓鞘的脫失和變性[1]。CNS的白質(zhì)和灰質(zhì)中廣泛存在神經(jīng)前體細(xì)胞，這類細(xì)胞在脫髓鞘損傷后能分化為成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞并參與新髓鞘的形成[2]。雖然腦內(nèi)存在自發(fā)性的髓鞘再生的保護(hù)性機制，但這些前體細(xì)胞的分化多數(shù)情況下被抑制，且這種內(nèi)源性的神經(jīng)再生不足以修復(fù)卒中后的神經(jīng)功能障礙。

近年來Sonic Hedgehog (Shh)信號通路因與神經(jīng)組織發(fā)生及神經(jīng)前體細(xì)胞增殖、分化、遷移的密切關(guān)系而備受關(guān)注。Shh信號通路主要包括Shh配體，Patched (Ptch)和Smo受體以及Gli轉(zhuǎn)錄因子[3]。研究發(fā)現(xiàn)Shh信號通路可能參與腦損傷后的神經(jīng)再生，使用外源性Shh蛋白能促進(jìn)缺血動物模型的神經(jīng)功能恢復(fù)[4]。有文獻(xiàn)觀察到腦缺血后Shh信號通路成分表達(dá)上調(diào)，而在缺血性腦損傷后紋狀體區(qū)域Shh信號通路成分的動態(tài)變化及與髓鞘損傷修復(fù)的關(guān)系未有報道。本實驗系統(tǒng)的觀察了大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO) 2h后再灌注大鼠Shh、Gli1及MBP在腦內(nèi)的分布及不同時間點的表達(dá)變化，并探討Shh參與髓鞘修復(fù)的可能性機制，為臨床脫髓鞘疾病的治療提供理論依據(jù)。

1　材料和方法

1.1動物分組和MCAO模型制備雄性SD大鼠由大連醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，體重280～320 g。隨機分成6組，分別是正常對照組、缺血2 h再灌注1 d、3 d、7 d和14 d組。每組8只，其中4只用于免疫組織化學(xué)分析，4只用于RT-PCR mRNA檢測。采用Nagasawa[5]方法，改良線栓法制成MCAO模型。大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉(0.35 g/kg)，仰臥位固定，經(jīng)頸部正中切開皮膚暴露右側(cè)頸總動脈、頸外動脈、頸內(nèi)動脈顱外段，結(jié)扎頸外動脈主干，在頸外動脈近頸總動脈分叉處剪一切口，將線栓向頸內(nèi)動脈顱內(nèi)方向插入17～20 mm，遇阻力表明栓子頭端已達(dá)大腦中動脈起始部并進(jìn)入大腦前動脈，阻斷了大腦中動脈的血流導(dǎo)致腦缺血，結(jié)扎入口處以固定線栓。術(shù)后大鼠不能直行，向缺血對側(cè)劃圈爬行或傾倒，提尾懸空時患側(cè)前肢屈曲內(nèi)收，提示腦缺血制作成功；2 h后直接拔出線栓恢復(fù)血流，實現(xiàn)再灌注。

1.2免疫組織化學(xué)實驗再灌注后1 d、3 d、7 d和14 d，動物經(jīng)10%水合氯醛(300 mg/kg，i.p.)麻醉后，打開胸腔，行左心室灌流。取出腦組織，放于恒冷切片機中做連續(xù)切片，切片厚度20 μm。腦片經(jīng)水化、滅活內(nèi)源性過氧化氫酶、封閉，分別加入Shh多克隆抗體(Santa Cruz，1：50)，Gli1多克隆抗體(Santa Cruz，1：50)和MBP多克隆抗體(武漢博士德，1：750)，4℃過夜后，依次加入生物素標(biāo)記的二抗(SP 9002，北京中杉)、辣根過氧化酶標(biāo)記鏈酶卵白素(SP 9002，北京中杉)，之后3，3’聯(lián)苯二胺(DAB)顯色，梯度酒精脫水，二甲苯透明，封片后顯微鏡下照相。

1.3RT-PCR mRNA檢測各組大鼠于再灌注后按上述時間點斷頭，取出缺血側(cè)紋狀體組織，每100 mg組織中加入1 ml Trizol提取總RNA，通過瓊脂糖電泳檢測RNA的完整性，分光光度計測定RNA的濃度和純度。取4 ul總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，建議PCR反應(yīng)體系。引物序列由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司設(shè)計并合成。Shh基因上游引物：5’-CATAGGCTCCCTTGCTCTCA-3’，下游引物：5’-TAACAACCAGCGTCTTCCTG-3’，產(chǎn)物長度501bp；Gli1基因上游引物：5’-CAGTCAGGTCCCTACCCTCA-3’，產(chǎn)物長度304 bp；MBP基因上游引物：5’-TGATTGGACAGTGGTGATGG-3’，下游引物：5’-TGTGAGAAGGACAAAGGTAGCA TGTGAGAAGGACAAAGGTAGCA-3’，產(chǎn)物長度100 bp。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性2 min，1個循環(huán)；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35個循環(huán)；72 ℃總延伸6 min。實驗中以GAPDH為內(nèi)參。

1.4圖像分析圖像采集應(yīng)用Spot Advanced軟件，分析處理采用Metamorph對缺血側(cè)紋狀體區(qū)域Shh，Gli1和MBP染色進(jìn)行灰度分析。每只大鼠選取6張切片，紋狀體的平均灰度值為右側(cè)紋狀體平均灰度與白質(zhì)的平均灰度的差值，將6張切片累加求其平均。每個時間點3只動物。RT-PCR擴(kuò)增后得到所需目的基因的RNA電泳鑒定后采用圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析，根據(jù)目的條帶與內(nèi)參GAPDH的mRNA條帶灰度值的比值計算其相對含量。

2　結(jié)　果

2.1局灶性腦缺血大鼠缺血側(cè)紋狀體區(qū)域Shh，Gli和MBP的免疫組化染色免疫組化顯示Shh和Gli1免疫陽性反應(yīng)的細(xì)胞廣泛分布與大腦皮質(zhì)，胼胝體，紋狀體等區(qū)域，Shh和Gli1呈棕黃色顆粒主要表達(dá)與細(xì)胞漿和細(xì)胞核；腦缺血后Shh和Gli1免疫陽性染色明顯增加。MBP在紋狀體區(qū)域呈簇狀分布，缺血后觀察到髓鞘的脫失、變性，纖維間間距的形成。

正常組和MCAO模型組均有Shh，Gli1蛋白表達(dá)，正常和缺血側(cè)紋狀體區(qū)域的平均光密度定量分析顯示，模型組Shh和Gli1表達(dá)與3 d，7 d和14 d呈逐漸上升趨勢(*P<0.05)。MBP在腦缺血后3 d～14 d呈逐漸下降趨勢(*P<0.05) (見表1)。

2.2局灶性腦缺血大鼠缺血側(cè)紋狀體區(qū)域Shh，Gli1和MBP的mRNA表達(dá)RT-PCR顯示，正常組即有Shh和Gli1 mRNA的表達(dá)。腦缺血后3 d Shh表達(dá)開始升高(*P<0.05)，并與7 d和14 d呈逐漸上升趨勢(**P<0.01) (見圖1)。Gli1表達(dá)在腦缺血后3 d開始升高(*P<0.05)，并與7 d達(dá)峰值，并維持此水平至腦缺血后的14 d(**P<0.01) (見圖2)。MBP的表達(dá)在腦缺血后1 d開始下降(*P<0.05)，7 d和14 d呈逐漸下降趨勢(**P<0.01) (見圖3)。

表1　MCAO大鼠腦缺血后不同時間點缺血側(cè)紋狀體區(qū)域Shh，Gli1和MBP灰度值比較 ±s)

與正常對照組相比*P<0.05

圖1　MCAO模型大鼠腦缺血后不同時間點Shh mRNA的表達(dá)情況。與正常對照組相比 * P<0.05，** P<0.01

圖2　MCAO模型大鼠腦缺血后不同時間點Gli1 mRNA的表達(dá)情況。與正常對照組相比 * P<0.05，** P<0.01

圖3　MCAO模型大鼠腦缺血后不同時間點MBP mRNA的表達(dá)情況。與正常對照組相比 * P<0.05，** P<0.01

3　討　論

1980年，Nusslein-Volhard和Wieschaus在研究果蠅的基因突變時發(fā)現(xiàn)了Hh基因，該基因編碼高度保守的糖蛋白，在果蠅中僅有一種形式的Hh基因，在哺乳動物中則存在三種同源基因：Sonic hedgehog (Shh)、Indian hedgehog (Ihh)和Desert hedgehog (Dhh)，分別編碼三種相應(yīng)蛋白[6]。其中Ihh特征性地參與軟骨發(fā)育；Dhh在生殖細(xì)胞的發(fā)育中起關(guān)鍵作用；Shh在Hh家族中具有最廣泛表達(dá)，在胚胎發(fā)育過程中對各器官的分化成形起重要調(diào)節(jié)作用，出生后Shh在組織器官完整性和功能發(fā)育保持中起到重要作用，并能調(diào)控細(xì)胞的分化和增殖，參與腦損傷后的神經(jīng)修復(fù)過程。Shh信號通路主要由Shh配體，兩個跨膜蛋白受體Ptched (Ptc)和Smoothened (Smo)組成的復(fù)合物，以及下游轉(zhuǎn)錄因子Gli蛋白 (Gli1，Gli2，Gli3)組成。當(dāng)不存在Shh時，Ptc抑制Smo的活性，從而抑制目標(biāo)基因的表達(dá)；當(dāng)Shh與Ptc結(jié)合時，Ptc對 Smo的抑制作用解除，Smo的功能被釋放出來，將信號傳遞并激活下游的Gli，后者進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，啟動多種目的基因的表達(dá)[7～9]。Gli1既是Shh信號的靶基因，又是Shh信號通路被激活的標(biāo)志。

Shh可調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞的增殖，分化和軸突形成[10～12]。最近研究表明，在胚胎期CNS內(nèi)的參與神經(jīng)發(fā)生的一系列塑型因子，在成體神經(jīng)損傷后重新激活，參與神經(jīng)組織的修復(fù)重建。Shh信號通路，特別是Gli1在完成胚胎的體節(jié)發(fā)育和細(xì)胞定位后，處于失活狀態(tài)，損傷后導(dǎo)致其重新激活。我們的研究檢測到Shh信號通路成分Shh和下游轉(zhuǎn)錄因子Gli1在成年大鼠腦內(nèi)(大腦皮質(zhì)，紋狀體，胼胝體等)均有表達(dá)，表明Shh信號在未損傷的成年腦中是有功能的。同時我們觀測到局灶性腦缺血后3 d，缺血側(cè)Shh，Gli1 mRNA和蛋白表達(dá)開始增加，7 d和14 d呈逐漸上升的趨勢，對側(cè)紋狀體中沒有發(fā)現(xiàn)此種改變，提示Shh表達(dá)水平的改變和損傷相關(guān)，腦缺血后內(nèi)源性Shh通路被激活。這與文獻(xiàn)報道的一致，在阻斷大腦中動脈血流20 min再灌注的大鼠模型中，Shh及其轉(zhuǎn)錄因子Gli1在缺血側(cè)表達(dá)增高[13]；在皮質(zhì)缺血的小卒中動物模型中，Shh在缺血側(cè)皮質(zhì)和紋狀體區(qū)域表達(dá)上調(diào)[14]；多發(fā)性硬化的實驗性動物模型和患者中Shh表達(dá)水平發(fā)生改變。那么，Shh主要表達(dá)與何種細(xì)胞，激活后發(fā)揮了何種作用？有文獻(xiàn)報道，激活的Shh主要表達(dá)與NG2+陽性的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞，參與了髓鞘修復(fù)過程[15]；另有研究者觀察到成年鼠海馬和從海馬區(qū)分離出的神經(jīng)前體細(xì)胞均高表達(dá)Shh的受體Ptc。用腺病毒載體輸注Shh cDNA到海馬，細(xì)胞增殖3倍；Shh抑制劑環(huán)巴明抑制Shh后，海馬神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖顯著減少[16]?？梢姡琒hh可以調(diào)控腦缺血后前體細(xì)胞的分化和成熟，促進(jìn)髓鞘再生，提示Shh信號通路可能成為腦缺血治療的潛在理想靶點，促進(jìn)缺血后的神經(jīng)功能修復(fù)。

MBP作為髓鞘的組成成分之一，是少突膠質(zhì)成熟和髓鞘的標(biāo)志物。實驗觀察到，MBP mRNA表達(dá)在腦缺血后的1 d～14 d逐漸下降，14 d達(dá)到最低點。這反應(yīng)了髓鞘的脫失和破壞發(fā)生在缺血的早期，并隨著缺血時間的延長逐漸加重。同時我們對缺血側(cè)紋狀體區(qū)域的髓鞘和軸突進(jìn)行了形態(tài)學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)缺血后髓鞘脫失、排列方向紊亂、神經(jīng)纖維間空洞形成以及染色強度下降，同時軸突也發(fā)生類似的改變，這種改變進(jìn)行性加重直到損傷后的14 d。髓鞘染色的變化和此次實驗檢測的MBP mRNA表達(dá)結(jié)果相吻合。

Shh能夠促進(jìn)髓鞘再生，但缺血后其表達(dá)變化和MBP的變化并不一致：Shh在損傷后的3 d到14 d逐漸增加，但MBP的表達(dá)在進(jìn)行性下降。Shh調(diào)控細(xì)胞增殖，參與脫髓鞘損傷后的修復(fù)，其表達(dá)生理性增加時，髓鞘并沒有修復(fù)的跡象，推測內(nèi)源性激活的正常量的Shh對于髓鞘的重建是不足夠的。另外，髓鞘抑制因子的存在以及受損髓鞘的殘骸未能被巨噬細(xì)胞及時清除對于髓鞘再生也有抑制性的作用。可見，雖然腦缺血可以啟動內(nèi)源性神經(jīng)再生的保護(hù)性機制，但是這種內(nèi)源性的反應(yīng)遠(yuǎn)不能替代腦卒中等破壞性較大的創(chuàng)傷所造成的神經(jīng)元或膠質(zhì)細(xì)胞的脫失，因此，損傷大腦尚不能達(dá)到自我修復(fù)的程度。那么，上調(diào)Shh表達(dá)對神經(jīng)修復(fù)有何影響？有研究顯示脊髓損傷大鼠局部給予Shh或Shh信號通路的激動劑將會加速前體細(xì)胞的增殖、分化和成熟，并促進(jìn)脊髓功能的恢復(fù)[17]；腦缺血模型大鼠，缺血后24 h鞘內(nèi)給予Shh蛋白能促進(jìn)神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖，減少梗死灶體積并促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)[18]?？梢?，上調(diào)Shh的表達(dá)能促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)?？傊?，Shh對腦缺血后神經(jīng)修復(fù)作用的具體機制仍需進(jìn)一步的研究。了解調(diào)控內(nèi)源性神經(jīng)修復(fù)背后的分子機制，以求應(yīng)用神經(jīng)修復(fù)治療的手段增強卒中后內(nèi)源性神經(jīng)修復(fù)，將為腦缺血后的神經(jīng)康復(fù)研究提供重要的理論依據(jù)和新的治療途徑。

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The expression changes of Sonic Hedgehog signaling pathway in the striatum after focal cerebral ischemia in rats and its role on remyelination

ZHAOHong，WUXiaojun，LIUZanhua，etal.

(DepartmentofNeurology，DalianMunicipalCentralHospital，Liaoning116033，China)

ObjectiveSonic Hedgehog (Shh) signal pathway regulates precursor cells proliferation and differentiation and is involved in the neurogenesis after ischemia. Our study is to explore the expression changes of Shh and its transcription factor Gli1 at different time points after focal cerebral ischemia and the effect of Shh on myelin repair. MethodsWe used the middle cerebral artery occlusion (MCAO) for 120 min as a rat model. MBP was used as a marker of myelin. Used immunohistochemistry and RT-PCR technique，we detected the expression of Shh，Gli1 and MBP at different time points after focal cerebral ischemia. ResultsShh and Gli1 were distributed throughout the white and gray matter of the normal brain，such as cortex (Cx)，corpus callosum (cc) and striatum (Str). In addition，Shh and Gli1 expression significantly increased from day 3 to day 14 after MCAO. The expression of MBP gradually reduced from day 1 to day 14 in MCAO rats. ConclusionThe ischemia injury can activate Shh signal pathway. The activation of Shh might promote remyelination through regulating the neural precursor cells proliferation，which might have implications in the treatment of demyelinating disease.

Focal cerebral ischemia；Sonic Hedgehog (Shh) singal pathway；Gli1；Remyelination

1003-2754(2016)07-0629-04

2016-01-12；

2016-05-20

(1.大連市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，大連 遼寧116033；2.大連醫(yī)科大學(xué)在讀研究生，大連 遼寧 116044)

王蘇平，E-mail：zhaohong2003@126.com

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