兩個蘇丹草品系成熟種子的組織培養和植株再生研究

李杰勤， 王麗華， 詹秋文， 胡能兵， 王世建

( 安徽科技學院 農學院， 安徽 鳳陽 233100 )

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兩個蘇丹草品系成熟種子的組織培養和植株再生研究

李杰勤， 王麗華， 詹秋文， 胡能兵， 王世建

( 安徽科技學院 農學院， 安徽 鳳陽 233100 )

該研究以蘇丹草品系S722和Sa的成熟種子為外植體、MS培養基為基礎培養基，2，4-D和NAA各3個濃度共6個處理對這兩個蘇丹草品系成熟種子進行愈傷誘導，探討不同品系在不同植物生長物質濃度及植物生長物質組合中誘導愈傷組織和繼代培養以及分化的能力。結果表明：蘇丹草S722和Sa成熟種子的愈傷誘導率差異不顯著，平均誘導率為17.19%。誘導培養基中2，4-D濃度為0.5或1 mg·L-1時，誘導效果最佳，而添加NAA不能提高愈傷誘導率。在繼代培養中，設定2，4-D和6-BA各兩個濃度共4個處理組合，處理1(2，4-D 1 mg·L-1+6-BA 0 mg·L-1)的繼代培養效果最佳。為了解不同植物生長物質對愈傷分化的影響，設定6-BA、NAA 各兩個不同濃度、KT 3個不同濃度共5個處理組合對繼代培養的愈傷進行分化培養。在5個處理中，處理1(6-BA 2 mg·L-1+NAA 0 mg·L-1+KT 0 mg·L-1)對S722成熟種子誘導的愈傷分化率最高，達33.3%。在這兩個蘇丹草品系中，S722更容易分化培養。綜上結果表明，2，4-D濃度為1 mg·L-1時誘導愈傷和繼代培養效果較好，6-BA濃度為2 mg·L-1時分化效果較好。另外，針對不同蘇丹草品系進行組織培養和植株再生時，適當調整植物生長物質濃度能提高植株再生的成功率。

蘇丹草， 種子， 組織培養， 植株再生， 植物生長物質

蘇丹草(Sorghumsudanese)為禾本科高粱屬一年生草本植物，原產于非洲的蘇丹，因其飼草產量高，再生能力強，營養價值豐富，適應范圍廣等優點，在我國大部分地區都有栽種(詹秋文等，2001)。蘇丹草是長江中下游地區最主要的夏季牧草，占該區域暖季型牧草種植面積在70%以上(徐玉鵬等，2003)。由于受夏季高溫高濕影響，蘇丹草在該地區種植時病害較重，影響其產量和品質。

轉基因技術已成為育種的一種重要手段，而組織培養技術則是轉基因技術的基礎。因此，通過轉基因技術來提高蘇丹草的抗病性，將成為蘇丹草抗病育種的一種新途徑。目前，以組織培養技術為基礎的轉基因技術已經在水稻、玉米和棉花上得到了廣泛應用(賈士榮等，2014；李娜等，2012；趙丹等，2013)。但與這些作物相比，通過組織培養獲得高粱和蘇丹草的再生植株則更難一些(Gurel et al, 2009；Liu & Godwin, 2012)。另外，組織培養技術在作物的種質保存方面也有重要應用(姚紹嫦等，2014；張衛華等，2014)。但蘇丹草組織培養和植株再生的研究報道還較少。鐘小仙等(2005)以蘇丹草品系2098的幼穗為外植體進行組織培養，并獲得了再生植株。王立艷等(2006)以蘇丹草品系185成熟種子為外植體，研究了不同植物生長物質配比對愈傷組織誘導率的影響，但未獲得再生植株。利用種子為外植體進行組織培養具有不受季節限制、取材方便的優點。但目前還未見以不同的蘇丹草品系成熟種子為外植體，并獲得再生植株的相關報道。本研究以本課題組培育的優質蘇丹草品系Sa和S722種子為外植體，試圖探明不同植物生長物質的組合對種子愈傷組織的誘導和分化以及植株再生能力的影響，為蘇丹草的轉基因育種和功能基因組學的研究奠定良好的基礎。

1　材料與方法

1.1 材料與藥劑

1.1.1 材料 本研究的材料為本課題組選育的蘇丹草品系Sa和S722的成熟種子。1.1.2 藥劑藥劑NH4NO3、KNO3、CaCl2·2H2O、MaSO4·2H2O、KH2PO4、KI、H3BO3、MnSO4·H2O、ZnSO4·7H2O、Na2MoO4·2H2O、CuSO4· 5H2O、CoCl2·6H2O、FeSO4·7H2O、EDTA-Na2·2H2O、HgCl2、甘氨酸、鹽酸硫胺素、鹽酸吡哆醇、煙酸、肌醇、2,4-D、6-BA、NAA、KT等為分析純。所配MS培養基pH值為5.6～6.0，蔗糖30 g·L-1，瓊脂5 g·L-1。

1.2 方法

1.2.1 兩個蘇丹草品系Sa和S722成熟種子的滅菌處理分別取蘇丹草品系Sa和S722成熟種子192粒，放在自來水下沖洗5～10 min。在超凈工作臺面上，先用70%酒精處理30 s(輕輕搖動)后倒掉酒精；再用0.1%升汞處理15 min，無菌水沖洗4～5次。將處理過的種子放入滅菌的小三角瓶中，加入1/3無菌水，放在振蕩器上振蕩12 h左右。

1.2.2 兩個蘇丹草品系Sa和S722成熟種子愈傷組織的誘導每個處理組合每品系接8瓶，每瓶2粒種子，接種時將種子橫切為兩半，即每瓶接4個半粒的種子進行成熟種子的愈傷組織誘導。基本培養基為MS培養基，用于愈傷組織誘導的植物生長物質處理組合見表1。接種2周后統計愈傷誘導結果和污染情況。培養的溫度為25 ℃，光照10 h·d-1，光照強度1 500 lx，黑暗14 h·d-1。

愈傷誘導率 = 出愈傷組織的外植體個數/接種的全部外植體個數 × 100%。

表 1　蘇丹草愈傷組織誘導的植物生長物質處理組合

1.2.3 兩個蘇丹草品系Sa和S722成熟種子誘導的愈傷組織繼代培養接種2周后，對愈傷組織進行繼代培養。繼代培養的基本培養基為MS培養基，愈傷組織繼代培養的植物生長物質處理組合見表2，每個品系接種8瓶。繼代培養2周后進行結果統計，培養條件和愈傷組織誘導的條件相同。

表 2　蘇丹草愈傷組織繼代培養的植物生長物質處理組合

1.2.4 兩個蘇丹草品系Sa和S722成熟種子誘導的愈傷組織分化培養繼代培養3周后，對繼代培養的愈傷組織進行分化培養，每品系每個處理組合接5瓶。基礎培養基為MS培養基，用于分化培養的植物生長物質處理組合見表3。培養溫度為25 ℃，光照14 h·d-1，光照強度1 500 lx，黑暗10 h·d-1。

分化率=成苗數/接種數 × 100%

1.2.5 兩個蘇丹草品系Sa和S722分化苗的移栽當分化苗長到10 cm左右時，將其移栽到小營養缽中(根上的小塊培養基不去除)，并加入適量的營養土。先將移栽的苗放在與分化培養相同溫度和光照強度的培養箱中煉苗1周后，再放到室外培養1周，移栽到大田，并統計成活率。

成活率 = 成活苗數/分化苗數 × 100%

表 3　蘇丹草愈傷組織分化培養的植物生長物質處理組合

1.3 數據統計與分析

數據統計與分析在Excel和DPS軟件中完成。

2　結果與分析

2.1 兩個蘇丹草品系Sa和S722成熟種子愈傷組織誘導比較分析

從總體上來看，這兩個蘇丹草品系成熟種子的愈傷組織誘導率不高，平均為17.19%；而褐化率較高，平均達33.33%(表4)。這兩個品系誘導出的愈傷組織顏色和特征基本相似，都是白色半透明、疏松質軟，成不規則的塊狀(圖1)。

6個處理之間愈傷組織形成率差異較大，最小的為處理6，平均為4.69%，而最大的為處理4，平均為21.88%。統計分析結果表明，這6個處理的愈傷組織形成率之間差異顯著，但前5個處理之間差異不顯著。這說明當2,4-D和NAA(萘乙酸)都為較大濃度時，蘇丹草愈傷組織的形成率降低較明顯。從以上結果看出，添加NAA不但不能提高蘇丹草成熟種子愈傷的誘導率，在較大濃度時還會使誘導率降低。因此， 2,4-D對蘇丹草成熟種子愈傷組織形成率起促進作用，而誘導培養過程中合適的2,4-D濃度為0.5或1 mg·L-1。

圖 1　蘇丹草品系Sa和S722成熟種子誘導的愈傷組織　A. Sa; B. S722。下同。Fig. 1　Callus induced from mature seeds of Sa and S722　A. Sa; B. S722. The same below.

表 4　兩個蘇丹草品系Sa和S722成熟種子誘導愈傷結果

注： 不同小寫字母表示在0.05水平上顯著。下同。

Note: Different small letters mean significant differences at 0.05 level. The same below.

另外，進一步比較這兩個蘇丹草品系的愈傷組織形成率則表明，兩個蘇丹草品系成熟種子的愈傷誘導率差異不顯著。

2.2 兩個蘇丹草品系Sa和S722成熟種子誘導的愈傷組織繼代培養的比較分析

為了解植物生長物質對愈傷組織繼代增殖的影響，設定2種不同濃度的6-BA與2，4-D組合對愈傷組織進行繼代增殖。結果表明，處理2(2,4-D 1.0 mg·L-1+6-BA 0.5 mg·L-1)的效果很差，愈傷組織接種以后變為黃褐色，生長很慢(圖2:A)。相反，處理1(2,4-D 1.0 mg·L-1)的效果較好，愈傷組織為淡黃色，質地疏松，增殖較快(圖2: B)。這說明在增殖培養基中添加6-BA，對愈傷組織生長有抑制作用，并導致愈傷組織褐化。

2.3 兩個蘇丹草品系Sa和S722成熟種子誘導的愈傷組織分化培養結果的比較分析

從5個不同植物生長物質處理的結果來看，這5個處理都能使愈傷組織分化成苗，但不同處理組合的分化效果不一致。從分化的時間上來看，從出現綠點到芽的形成一般為4～9 d。這5個處理分化效果有較大差異，其中只有處理3能使這兩個蘇丹草品系都分化成苗。另外，在這5個處理中，只有處理5不能使S722分化成苗，而其它4個處理都能夠使S722分化成苗。這說明相對于蘇丹草品系Sa來看，S722更容易分化成苗。因此，對于不同的蘇丹草品系其分化效果不一致，如S722處理1的分化率最高，達33.3%。綜合看來，不同蘇丹草品系對植物生長物質種類及濃度要求不同。如果需要達到最佳的分化效果，研究者應對不同的蘇丹草品系愈傷植物生長物質濃度進行優化。

2.4 兩個蘇丹草Sa和S722品系再生植株的移栽分析

愈傷分化出苗1個月，對再生植株進行煉苗和移栽。結果表明S722的移栽成活率達65%，Sa的成活率則達75%。這說明再生植株能成活， 而且這兩個蘇丹草品系再生植株的成活率較高。

圖 3　蘇丹草品系Sa和S722分化成苗Fig. 3　Regenerated plants of Sa and S722

表 5　兩個蘇丹草品系Sa和S722成熟種子誘導的愈傷組織繼代培養結果

3　討論

蘇丹草為高粱屬草本植物，而高粱是公認的組織培養較困難的一種作物。目前，對于蘇丹草組織培養的研究還較少，所選用的外植體只有成熟種子和幼穗。鐘小仙等(2005)利用蘇丹草幼穗進行愈傷誘導，誘導頻率為80%～90%，誘導率較高。王立艷等 (2006) 利用蘇丹草185的成熟種子進行愈傷誘導，誘導率最高為26.6%。在本研究中，蘇丹草S722在2，4-D濃度為0.5 mg·L-1加NAA為0.2 mg·L-1的MS培養中的誘導率為31.25%，而Sa在2，4-D濃度為1 mg·L-1的MS培養基上的誘導率為25%。從上述可以看出，幼穗為外植體的誘導率遠高于成熟種子，但成熟種子具有取材方便，在進行組織培養時不受季節限制的優點。本研究中，成熟種子誘導率較低，其主要原因是褐化率較高。因此，如何控制褐化來提高誘導率則需要更進一步的研究。

表 6　兩個蘇丹草品系Sa和S722成熟種子誘導的愈傷組織分化培養結果

蘇丹草和所有高粱屬植物一樣，在組織培養過程中易褐化，褐化產生的酚類物質影響愈傷的生長，嚴重時導致愈傷死亡。呂宗友等(2011)研究表明，活性炭、Vc、PVP和AgNO3均能不同程度地降低褐化率。Wu et al(2014)對高粱的研究表明，丹寧含量較低的高粱材料其褐化率也較低。在本研究中，在繼代培養和分化培養時，不同的植物生長物質處理也會造成愈傷組織褐化。例如，在繼代培養中添加6-BA會造成蘇丹草愈傷組織褐化。因此，在對高粱屬植物進行組織培養中，適當的植物生長物質水平是需要考慮的一個重要因素。

高粱的組織培養研究表明，不同的高粱材料愈傷誘導率有較大差異，例如高粱Tx430就比較容易成功(朱莉等, 2011; Liu et al, 2014; Zhao et al, 2000)。本研究中，蘇丹草S722和Sa在愈傷誘導率上差異不顯著，但在最后的分化成苗則表現出較大的差異，S722更容易分化成苗。這說明，不同的品系之間在組織培養上有較大的差異。因此，選用更容易進行分化的材料，能更容易獲得再生植株。本研究則表明S722比Sa更適合進行組織培養。

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Tissue culture and plant regeneration using mature seeds of two sudangrass strains

LI Jie-Qin, WANG Li-Hua, ZHAN Qiu-Wen, HU Neng-Bing, WANG Shi-Jian

(CollegeofAgriculture,AnhuiScienceandTechnologyUniversity, Fengyang 233100, China )

In the study, mature seeds of sudangrass strains S722 and Sa as explants were used to study the factors affecting callus induction, subculture and differentiation using different combinations of plant growth substances and MS (Murashige and Skoog) media for basic media. Six treatment combinations, including three different levels of 2,4-D and NAA, were used to induce callus from mature seeds of two sudangrass strains in callus induction process. The results showed that the percentage of callus induction was not significantly different between the two sudangrass strains. And the average percentage of callus induction was 17.19% for the two sudangrass strains. The proper concentration of 2, 4-D for callus induction was 0.5 or 1 mg·L-1in MS media. The percentage of callus induction did not changed when NAA was added in basic media in callus induction process. The results showed that it was not helpful for callus induction when NAA was added in MS basic media. Four treatment combinations including two different concentrations of 2,4-D and 6-BA were used to subculture for induced callus. The best combination was treatment No. 1, which included 1 mg·L-12, 4-D and 0 mg·L-16-BA. When 6-BA was added in MS basic media, callus became brown and the growth of callus was also inhibited. These results indicated that 6-BA inhibited the growth of callus in subculture process when 6-BA was added in MS basic media. To gain a better understanding about the effects of different combinations of plant growth substances in callus differentiation, five treatment combinations including two different 6-BA and NAA concentrations and three different concentrations of KT were used to differentiate for callus when the callus had been subcultured. Treatment No.1 was the best combination in the five treatment combinations. And the differentiation rate of callus from mature seeds of S722 was 33.3% when 2 mg·L-16-BA was added in MS basic media. It was the highest differentiation rate when the concentration of 6-BA was added in media. Callus from S722 mature seeds were more easily differentiated than the other sudangrass strain Sa. Summarily, the best concentration of 2,4-D for callus induction and subculture was 1 mg·L-1in basic media when mature sudangrass seeds were used for explants. 6-BA had inhibition effects for callus in subculture process. And the best concentration of 6-BA for callus differentiation was 2 mg·L-1in basic media. The different sudangrass strains should use different combinations of plant growth substances in tissue culture process. Therefore, plant regeneration rate would be improved if the concentrations and combinations of plant growth substances were adjusted in media for tissue culture and plant regeneration of sudangrass when different sudangrass strain’s mature seeds were used as explants.

sudangrass, seeds, tissue culture, plant regeneration, plant growth substances

10.11931/guihaia.gxzw201409050李杰勤， 王麗華， 詹秋文， 等. 兩個蘇丹草品系成熟種子的組織培養和植株再生研究[J]. 廣西植物， 2016， 36(8):930-936LI JQ, WANG LH, ZHAN QW， et al. Tissue culture and plant regeneration using mature seeds of two sudangrass strains[J]. Guihaia， 2016， 36(8):930-936

2014-09-26

2015-03-24

國家自然科學基金(31301383)；安徽科技學院自然科學研究項目(ZRC2013371)；國家“星火”計劃項目(2012GA710076)；安徽省省級學科建設重大項目—草學(皖教秘科[2014]28)；農業部科研任務專項(201503133)[Supported by the National Natural Science Foundation of China(31301383); Natural Science Research Program of Anhui Science and Technology Univesity(ZRC2013371)； National Spark Plan(2012GA710076); Anhui Key Program of Discipline ([2014]28); Special Fund for Scientific Research of Agricultural Ministry(31301383)]。

李杰勤(1980-)，男，四川屏山人，博士，講師，主要從事飼草遺傳育種研究，(E-mail) wlhljq@163.com。

Q943.1

A

1000-3142(2016)08-0930-07