鴨坦布蘇病毒病卵巢病變標準的判定

林 健，楊志遠，何平有，段會娟，鄒立宏，楊保收，趙際成，潘 潔，王小蕾，劉立新，劉月煥

（1北京市農林科學院畜牧獸醫研究所，北京 100097；2瑞普（保定）生物藥業有限公司，河北保定 071000）

鴨坦布蘇病毒病卵巢病變標準的判定

林 健1，楊志遠1，何平有2，段會娟1，鄒立宏2，楊保收2，趙際成1，潘 潔1，王小蕾1，劉立新1，劉月煥1

（1北京市農林科學院畜牧獸醫研究所，北京 100097；2瑞普（保定）生物藥業有限公司，河北保定 071000）

【目的】了解產蛋鴨感染鴨坦布蘇病毒后卵巢病變產生的進程和卵巢病變規律，為采用產蛋鴨卵巢病理變化檢查法進行疫苗效力檢驗提供依據。【方法】70只260日齡產蛋櫻桃谷鴨，以0.5mL/只（含100DID50）的劑量經胸部肌肉接種鴨坦布蘇病毒（HB株）強毒。觀察試驗鴨的臨床癥狀，統計每日產蛋數和采食量。攻毒后2 d，每只鴨經翅靜脈采血，分離血清，經卵黃囊途徑接種5枚6日齡SPF雞胚，每胚0.1mL。接種后置37℃條件下繼續孵化，24 h死亡雞胚棄去。采用RT-PCR方法測定24—72 h死亡雞胚的DTMUV核酸，將1/5或以上雞胚死亡且DTMUV核酸陽性的鴨判為DTMUV感染鴨。攻毒后4—10 d，每日剖殺10只鴨，觀察和分析生殖系統病變。統計病變率，檢查輸卵管內是否有蛋，卵泡是否變形、出血和破裂，依據病變率和病變，確定檢查內容和病變卵巢的判定時間和標準。【結果】（1）攻毒后3、4、5、6 d，鴨幾乎不采食，產蛋數明顯下降。攻毒后7 d，鴨精神狀況好轉；攻毒后8 d，采食量開始回升。（2）70只鴨中，除1只鴨的病毒分離結果為陰性外，其余69只鴨的病毒分離結果均為陽性，病毒分離陽性率為98.6%（69/70）。（3）攻毒后4—10 d，共64只產蛋期鴨的生殖器官可以判定。（4）攻毒后4、5、6、7、8、9和10 d，卵巢病變率分別為66.7%（6/9）、100%（10/10）、100%（10/10）、100%（9/9）、100%（9/9）、100%（9/9）和100%（8/8）。（5）除攻毒后4 d有2只鴨輸卵管中有蛋外，其余62只鴨輸卵管中均無蛋，無蛋率為96.9%（62/64）。（6）攻毒后4—10 d，96.9%（62/64）鴨的卵泡變形，96.9%（62/64）鴨的卵泡出血，95.3%（61/64）鴨的卵泡變形和出血，34.4%（22/64）卵泡破裂。【結論】（1）確定卵巢病理變化檢查時間為攻毒后7—8 d；（2）具有變形或出血病變之一，判病變卵泡。輸卵管內無蛋且有3個及以上病變卵泡，判為病變卵巢。

鴨坦布蘇病毒病；卵巢；病理變化

0　引言

【研究意義】2010年，在中國浙江等多個省市發現以產蛋鴨產蛋量急劇下降為主要特征的疾病，在病原不清楚的情況下，根據卵巢出血的大體病變，將該病暫命名為鴨出血性卵巢炎（duck hemorrhagic ovaritis，DHO）［1］，隨后經過病毒分離鑒定和病毒NS5片段的DNA序列同源性分析結果表明，引起上述鴨疫情的病毒為一種黃病毒、Ntaya病毒群中的Tembusu病毒［2-4］。2011年首屆水禽疫病防控研討會將該病統一命名為“鴨坦布蘇病毒病”［5］。鴨坦布蘇病毒病自從2010年流行以來，已經成為中國養鴨業的主要疾病之一。產蛋鴨發病后表現為持續性產蛋率低下，由于繼發感染和飼養管理不當等因素可致死亡率達到 15%—20%［1，3，6］。疫苗的預防接種是控制畜禽傳染病的重要手段。萬春和等［7］按照常規方法制備了鴨坦布蘇病毒病油乳劑滅活苗，并利用免疫鴨群平均產蛋率進行疫苗的效力評價，而李振華［8］等利用攻毒后鴨的臨床表現的剖檢病變來評價；林健等［9］首次使用疫苗保護效力PD50檢驗法對商品肉鴨進行了效力評價，攻毒試驗的結果表明研制的滅活苗安全有效。LI等［10-11］分別將鴨坦布蘇病毒在雞胚成纖維細胞和雞胚上進行連續傳代，獲得了致弱的疫苗候選株。ZOU等［12-13］利用反向遺傳操作平臺獲得了以鴨瘟病毒為載體的重組二價弱毒疫苗候選株。MA等［14］用逆向蒸發法構建了嵌入重組E蛋白的脂質體疫苗，效力評價時除利用病毒血癥，還采集咽拭子和肛拭子進行病毒分離。但不論是滅活疫苗、活疫苗還是基因工程疫苗，都需要建立疫苗的效力檢定方法，這對疫苗質量控制至關重要。制定產蛋鴨感染鴨坦布蘇病毒（duck Tembusu virus，DTMUV）后卵巢病變的適宜檢查時間和病變卵巢的判定標準，在利用卵巢病變評價疫苗的效力方面有意義。【前人研究進展】曹貞貞等學者確認引起鴨產蛋急劇下降的病原為黃病毒或坦布蘇病毒［1，15-16］。Tembusu病毒首次于1968年在Sarawak地區的蚊子體內分離到，曾一度認為家禽可能是病毒的自然宿主［17］。Tembusu病毒分別于1982和1992年在泰國北部日本腦炎流行地區蚊子體內分離到［18-19］。2000年，研究人員報道了一種新的名為Sitiawan的黃病毒感染雞后能夠引起雞生長發育受阻［20］，Sitiawan病毒與Tembusu病毒核酸的同源性為92%。中國從鴨體內分離到的Tembusu病毒與Bagaza病毒的核酸高度同源［21-22］。值得一提的是，溫立斌等學者于1995年從10周齡以上發病的康貝爾鴨肝脾組織中分離到似乎屬于黃病毒科的病毒，并將該病暫命名為“鴨病毒性腦炎”［23］。現有文獻資料表明，產蛋期鴨發病后，采食量減少和產蛋量急劇下降，卵泡變形、出血、液化或破裂。尚未見系統的卵巢病理變化檢查的適宜時間、檢查內容和病變卵巢判定標準的報道。【本研究切入點】本文通過對70只人工感染產蛋鴨的卵巢病變產生時間、病變檢查內容和判定標準進行系統研究。【擬解決的關鍵問題】解決鴨坦布蘇病毒感染產蛋鴨后，病變卵巢判定時間和判定標準的問題。為了解產蛋鴨感染鴨坦布蘇病毒后卵巢產生病變的進程，制定卵巢病變檢查的適宜時間和病變卵巢標準，為確定疫苗效力檢驗，何時檢查卵巢病理變化和如何判定病變卵巢提供依據。筆者開展了“卵巢病理變化檢查時間和病變卵巢判定標準”的研究。

1　材料與方法

1.1試驗地點和時間

試驗于2015年3月瑞普（保定）生物藥業有限公司負壓動物舍，實驗動物使用許可證號為 SYXK（Ji）2010-0045。

1.2材料

1.2.1毒株 鴨坦布蘇病毒HB株（DTMUV-HB），鴨胚 F4代，由北京市農林科學院畜牧獸醫研究所繁殖，鴨半數感染量（DID50）為107.7/0.5mL。

1.2.2櫻桃谷鴨 70只260日齡DTMUV抗體陰性產蛋櫻桃谷鴨，飼料和墊料，購自河北省保定市安新縣某養鴨場。

1.2.3試劑 滅菌 0.5%水解乳蛋白 Hank’s液（pH 7.2）。

1.3方法

1.3.1攻毒 70只鴨腿部標記，分別經胸部肌肉接種DTMUV-HB株強毒，每只0.5mL（含100DID50）。觀察試驗鴨的臨床癥狀，統計每日產蛋數和采食量。攻毒后2 d，采血分離病毒。攻毒后4—10 d，每日隨機取10只鴨（包括死亡鴨），剖殺，觀察卵巢病變。

1.3.2病毒分離 攻毒后2 d，每只鴨經翅靜脈采血分離血清。每只鴨的血清經卵黃囊途徑接種5枚6日齡SPF雞胚，每胚0.1mL。接種后置37℃條件下繼續孵化，24 h死亡雞胚棄去。采用RT-PCR方法測定24 —72 h死亡雞胚的DTMUV核酸，將1/5或以上雞胚死亡且DTMUV核酸陽性的鴨判為DTMUV感染鴨。

1.3.3生殖器官檢查 攻毒后4—10 d，每日隨機取10只鴨（包括死亡鴨），剖殺，觀察生殖器官病變（卵泡形狀和輸卵管內是否有蛋）。

1.3.3.1生殖器官檢查要求 僅檢查產蛋期鴨生殖器官，產蛋停止期和靜止期鴨不檢查（棄去）。

1.3.3.2檢查內容 檢查輸卵管內是否有蛋，卵泡是否變形、出血和破裂（通過觀察腹腔中是否有黃色、紅褐色、米黃色或土黃色等液體判定）。

1.3.3.3數據統計和分析 統計病變率，分析攻毒后4—10 d生殖器官明顯的病變特征。依據病變率和病變，確定檢查內容和病變卵巢的判定時間和標準。

2　結果

2.1臨床癥狀

攻毒后3、4、5和6 d，鴨幾乎不采食，產蛋數明顯下降。攻毒后7 d，鴨精神狀況好轉；攻毒后8 d，采食量開始回升。采食量和產蛋數結果見表1。

表1　攻毒后鴨采食量和產蛋量變化Table 1 Changes of feed intake and egg production of duck infected

2.2病毒分離

70只鴨中，除1只鴨（81號）的病毒分離結果為陰性外（雞胚于接種后72 h開始死亡），其余69只鴨的病毒分離結果均為陽性，病毒分離陽性率為98.6%（69/70）。

2.3生殖器官檢查

2.3.1產蛋停止和靜止期鴨 3只為產蛋停止期鴨，分別為33號（攻毒后7 d剖檢，圖1-A）、38號（攻毒后9 d剖檢）和41號（攻毒后10 d剖檢）；3只為產蛋靜止期鴨，分別為83號（攻毒后4 d剖檢，圖1-B）、29號（攻毒后8 d剖檢）和44號（攻毒后10 d剖檢）。共6只鴨生殖器官不能判定，棄去。

2.3.2產蛋期鴨 共64只產蛋期鴨的生殖器官可作后期試驗有效材料。

圖1　攻毒鴨后生殖器官病變Fig.1 Pathological changes of ducks infected

2.3.2.1輸卵管內是否有蛋 攻毒后4—10 d，除攻毒后4 d剖檢的2只鴨（24和32號）輸卵管子宮部有蛋（圖1-C）外，其余62只鴨輸卵管子宮部均無蛋，無蛋率為96.9%（62/64）。

2.3.2.2病變卵巢攻毒后4—10 d，96.9%（62/64）鴨的卵泡變形，96.9%（62/64）鴨的卵泡出血，除62號鴨卵巢僅變形（圖1-D）、63號鴨卵泡僅出血（圖1-E）和76號鴨（攻毒后4 d剖檢）卵泡正常（無變形和出血卵泡，圖1-F）外，其余61只鴨的卵巢均可觀察到卵泡變形和出血（圖1-G、圖1-H），34.4% （22/64）的卵泡破裂（圖1-I）。詳細結果見表2。

2.3.3發病率 攻毒后4、5、6、7、8、9和10 d，卵巢病變率分別為 66.7%（6/9）、100%（10/10）、100%（10/10）、100%（9/9）、100%（9/9）、100% （9/9）和100%（8/8）。詳細結果見表3。

3　討論

3.1卵巢病變檢查時間

試驗鴨攻毒后3 d采食量和對外界刺激反應能力等明顯下降，筆者前期的研究結果表明［24］，攻毒后 1 —3 d病毒分離率最高，在病毒血癥的早期并沒有明顯臨床癥狀，而是當病毒在靶細胞持續和大量增殖時才出現，這與本次試驗結果相一致。攻毒后7 d試驗鴨開始恢復，8、9和10 d采食量和精神狀況有明顯增加或好轉，這與解瑞欽等［25］的研究結果一致。卵巢病變率和病變的結果表明，攻毒后5—10 d，卵巢病變率均為 100%，但是隨著時間的推移，大型病變卵泡逐漸減少。攻毒后9 d，部分鴨腹腔內有臭味，有卵黃液或者卵黃痕跡，1只鴨卵巢萎縮，1只鴨卵巢有明顯萎縮傾向。攻毒后10 d，2只鴨的卵巢萎縮，其余8只鴨僅可見中小型卵泡明顯變形、出血。這表明，攻毒后9—10 d，不是檢查卵巢病變的適宜時間，將病變卵巢檢查時間確定為攻毒后7—8 d。

表2　攻毒鴨生殖器官檢查Table 2 Reproductive organs inspection on duck infected

表3　攻毒鴨病毒分離和卵巢病變Table 3 Virus isolation and ovarian pathological changes of duck infected

3.2卵巢病變檢查標準

由于激素等生理或病理性因素，產蛋母鴨經歷產蛋期、產蛋停止和靜止期3個階段。產蛋期鴨卵巢的直徑可達5—6 cm，常可見到3—4個體積依次遞增的大卵泡，其中最大的充滿卵黃的卵泡直徑約達 4—5 cm。本次試驗利用70只260日齡父母代櫻桃谷鴨，系統觀察和分析了攻毒后4—10 d產蛋鴨的生殖器官，結果表明，此次試驗共有8.6%（6/70）的鴨為非產蛋期鴨（產蛋停止和靜止期鴨）。由于非產蛋期鴨卵巢處于未發育或未成熟狀態，很難對卵泡病變進行判定，因此在利用產蛋鴨（卵巢病理變化檢查法）進行疫苗的效力檢驗時，應將非產蛋期鴨排除在外。此次試驗攻毒后5—10 d，攻毒鴨未見產蛋，剖檢鴨輸卵管內未見鴨蛋，將攻毒后7—8 d，只要輸卵管內有蛋，就判為正常。由于輸卵管里是否有蛋，與卵巢在特定時間段正常與否密切相關，而且判定時一目了然，易于判定，同時也能夠反映出產蛋鴨坦布蘇病毒病的臨床表現，因此，將輸卵管內是否有蛋列為檢查內容之一。筆者前期建立的人工感染模型中［26］，主要表現為急性出血性卵巢炎，此外，羅玲等［27］的研究也發現該病的臨床剖檢主要病變為卵巢嚴重充血、出血，此次試驗中感染鴨卵泡變形或出血的病變率均為 96.9%，而且既出血又變形的卵泡病變率為95.3%（61/64），明顯高于 34.4%的卵泡破裂病變率。因此，將卵泡變形和卵泡出血列為卵巢檢查內容之一，且將具有變形或出血病變之一，判為病變卵泡。結合應激對產蛋鴨產蛋性能影響的試驗結果（內部資料），綜合分析上述結果，制定病變卵巢判定標準：將輸卵管內無蛋，有 3個及以上病變卵泡。符合以上2條之一，判為病變卵巢。有時遇到卵泡數低于3個的鴨，規定如有病變卵泡，也判為病變卵巢。正常卵巢的判定標準如下：（1）輸卵管內有蛋；（2）輸卵管內無蛋，有2個及以下病變卵泡；（3）卵泡數低于 3個，無病變卵泡。符合上述3條之一者，判為正常卵巢。

4　結論

4.1卵巢病理變化檢查時間為攻毒后7—8 d。

4.2具有變形或出血病變之一，判病變卵泡。輸卵管內無蛋且有3個及以上病變卵泡，判為病變卵巢。

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（責任編輯 林鑒非）

Criterion of Ovarian Lesions of Duck Tembusu Virus Disease

LIN Jian1，YANG Zhi-yuan1，HE Ping-you2，DUAN Hui-juan1，ZOU Li-hong2，YANG Bao-shou2，ZHAO Ji-cheng1，PAN Jie1，WANG Xiao-lei1，LIU Li-xin1，LIU Yue-huan1
（1Institute of Animal and Husbandry Medicine，Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Beijing100097；2Ringpu（Baoding） Biological Pharmaceutical Co.，LTD，Baoding 071000，Hebei）

【Objective】The objective of this study is to understand the process and regularities of ovarian lesions on ducks infected with Duck Tembusu virus，and to provide data for the efficiency evaluation of vaccine using laying ducks ovary pathological inspection. 【Method】 Seventy 260-day-old laying cherry ducks were inoculated intramuscularly with Duck Tembusu virus （HB strain）at dosage of 0.5mL（100 DID50）/duck. Clinical symptoms were observed，and the egg production and feed intake were recorded daily. Serum samples were collected from all ducks for virus isolation via wing vein on 2 days post inoculation （dpi）. Each serum sample was inoculated into five 6-day-old SPF chicken embryos via yolk-sac route at the inoculum of 0.1 mL per embryo. Then they werehatched at 37℃ further. The chicken embryos died in 24h were abandoned. The viral nucleic acid was detected by RT-PCR in the death chicken embryos during 24-72 h. If there were more than one （including one） death chicken embryos，and the nucleic acid testing was positive，then it was concluded that virus isolation was positive. On 4-10 dpi，10 ducks were necropsied and the gross lesions of the reproductive system were observed every day. The pathologic rate was calculated，and the gross lesions of the reproductive system were conducted including whether there were eggs in the fallopian tube，whether the follicle was deformed，hemorrhaged or ruptured or not. According to the statistical pathologic rate，the time，the content of the examination and the criterions for determining lesion ovary were confirmed. 【Result】 （1） Feed intake and egg production decreased significantly on 3-6 dpi. The mental state of the duck on 7 dpi improved，and feed intake began to rise on 8 dpi. （2） Virus isolation of 70 ducks were all positive except one duck. The virus positive isolation rate was 98.6% （69/70） on 2 dpi. （3） On 4-10 dpi，a total of 64 laying duck reproductive organs can be determined. （4） On 4-10 dpi，the ovarian lesions rate were 66.7% （6/9），100% （10/10），100% （10/10），100% （9/9），100% （9/9），100% （9/9） and 100% （8/8） respectively. （5） Eggs were found in fallopian tube of 2 ducks among 10 ducks that were necropsied on 4 dpi，and there was no egg found in fallopian tube of the remaining 62 ducks. The egg negative rate was 96.9（62/64）. （6） On 4-10 dpi，the proportion of deformed follicular duck and hemorrhaged follicular duck were both 96.9% （62/64），and the proportion of deformed and hemorrhaged follicular duck was 95.3%（61/64），while the proportion of ruptured follicular duck was 34.4% （22/64）.【Conclusion】 （1） The time for the examination of the pathological changes of ovary was determined as 7 to 8 dpi. （2） The criterion of abnormal follicle is that one of the lesions of deformation and hemorrhage or both were found. The criterion of lesion ovary is that three abnormal follicles or more appeared and no egg in the fallopian tube.

duck tembusu virus disease； ovary； pathological change

2015-12-21；接受日期：2016-05-17

國家自然科學基金（310721597）、北京市自然科學基金（6072011）、北京市農林科學院創新能力建設專項（KJCX201104001）、北京市農林科學院青年基金（QNJJ201516）

聯系方式：林健，Tel：010-51503475；E-mail：dblinjian@sina.com。通信作者劉月煥，Tel：010-51503475；E-mail：liuyuehuan@sina.com