AZIN1慢病毒的制備及EC109穩(wěn)定感染細(xì)胞株的建立*

陳競紅，常志偉，賈永旭，秦艷茹

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科 鄭州 450052

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AZIN1慢病毒的制備及EC109穩(wěn)定感染細(xì)胞株的建立*

陳競紅，常志偉，賈永旭，秦艷茹#

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科 鄭州 450052

AZIN1基因；RNA編輯；慢病毒；EC109細(xì)胞

目的：制備野生型和編輯型AZIN1的慢病毒并建立穩(wěn)定感染的食管癌EC109細(xì)胞株。方法：用RT-PCR法從人食管鱗狀細(xì)胞癌組織中擴(kuò)增出AZIN1基因的cDNA序列，選取測序結(jié)果中目標(biāo)位點(diǎn)的A峰與G峰均高且與NCBI公布的基因編碼序列一致的PCR產(chǎn)物，克隆至慢病毒表達(dá)載體pLenti6/V5-D-TOPO，構(gòu)建野生型和編輯型AZIN1的重組慢病毒表達(dá)載體，經(jīng)酶切和測序鑒定后，經(jīng)293FT細(xì)胞包裝，制備相應(yīng)的慢病毒，然后感染EC109細(xì)胞株，行RT-PCR、測序和Western blot鑒定穩(wěn)定感染的EC109細(xì)胞株。結(jié)果：雙酶切重組慢病毒表達(dá)載體后產(chǎn)生了1 347 bp和6 915 bp的片段，經(jīng)測序證實(shí)1 347 bp片段為正確的AZIN1基因編碼序列；RT-PCR、測序和Western blot結(jié)果證實(shí)成功建立了穩(wěn)定感染的EC109細(xì)胞株。結(jié)論：成功制備了野生型和編輯型AZIN1的慢病毒并建立了穩(wěn)定感染的EC109細(xì)胞株。

RNA編輯泛指對RNA分子在轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行再加工和修飾的過程，能使基因編碼的遺傳信息在RNA水平上進(jìn)一步產(chǎn)生多樣性與可塑性，可能導(dǎo)致腫瘤特異性的“編輯/表觀遺傳突變”。研究[1]發(fā)現(xiàn)食管鱗狀細(xì)胞癌(簡稱食管鱗癌)中存在RNA腺苷脫氨酶(adenosine deaminase acting on RNA, ADAR)過表達(dá)并介導(dǎo)編碼抗酶抑制劑1(antizyme inhibitor 1, AZIN1)RNA(A→I)過度編輯，這種編輯型AZIN1作為一種獲得性功能表型有可能與食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。作者制備了重組野生型和編輯型AZIN1慢病毒，并建立了穩(wěn)定感染野生型AZIN1和編輯型AZIN1的EC109細(xì)胞株，為進(jìn)一步研究編輯型AZIN1在食管鱗癌中的作用機(jī)制和生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料食管鱗癌組織來自河南省林州市人民醫(yī)院手術(shù)切除的組織，患者在手術(shù)前均未接受放化療，液氮保存。pLenti6/V5-D-TOPO、Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑、Trizol試劑購自Invitrogen公司；stbl3感受態(tài)細(xì)胞，慢病毒包裝載體系統(tǒng)(由pLP1、pLP2、pLP VSV-G三種質(zhì)粒組成)，293FT細(xì)胞株及EC109細(xì)胞株由中山大學(xué)腫瘤防治中心實(shí)驗(yàn)研究部保存；限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ、XhoⅠ、T4 DNA連接酶購自Thermo Scientific公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒(離心柱型)購自Tiangen公司；DMEM培養(yǎng)基、Trypsin-EDTA細(xì)胞消化液、胎牛血清購自Gibco公司；KAPA2G Fast HotStart ReadyMix(2×)購自KAPA Biosystems公司，DNA Marker購自TaKaRa公司；BCA蛋白含量檢測試劑盒購自凱基生物公司；AZIN1抗體、β-tubulin抗體購自Abcam公司。

1.2目的基因的擴(kuò)增根據(jù)NCBI檢索，確定AZIN1的編碼區(qū)序列，設(shè)計(jì)引物如下。擴(kuò)增AZIN1編碼序列全長的引物F1：5’-CGCGGATCCGCCAC CATGAAAGGATTTATTGATGAT-3’(含BamH Ⅰ酶切位點(diǎn)),R1：5’-CCGCTCGAGTTAAGCTTCAGCG GAAAAGCT-3’(含XhoⅠ酶切位點(diǎn))。提取20例食管鱗癌患者癌組織的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA,以cDNA為模板用引物F1、R1進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為KAPA2G Fast HotStart ReadyMix(2×)25 μL,引物F1、R1各2.5 μL,cDNA 2 μL,滅菌蒸餾水18 μL。反應(yīng)條件：95 ℃變性2 min；然后95 ℃ 15 s，55 ℃ 10 s，72 ℃ 30 s，36個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。將PCR產(chǎn)物送至睿博興科生物技術(shù)有限公司測序，選取測序結(jié)果中目標(biāo)位點(diǎn)的A峰與G峰(序列色譜圖中I讀為G)均高且與NCBI公布的基因編碼序列一致的PCR產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，回收目的片段，紫外分光光度計(jì)法測定其濃度和純度。

1.3重組慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建PCR產(chǎn)物回收后與pLenti6/V5-D-TOPO同時(shí)進(jìn)行BamH Ⅰ和XhoⅠ雙酶切，37 ℃ 30 min，瓊脂糖凝膠電泳后回收，16 ℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化stbl3感受態(tài)細(xì)胞，將已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞加到含氨芐青霉素的LB固體瓊脂糖培養(yǎng)基上，將細(xì)胞均勻涂開，將平板置于37 ℃至液體被吸收，倒置平板，37 ℃培養(yǎng)過夜。隨機(jī)挑選10個(gè)菌落，分別搖菌擴(kuò)增后用無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒提取質(zhì)粒，BamH Ⅰ、XhoⅠ雙酶切鑒定后送測序，挑選出1個(gè)插入片段與NCBI公布的基因編碼序列一致的重組野生型AZIN1慢病毒表達(dá)載體和1個(gè)除編輯位點(diǎn)為I外，插入片段其余序列與NCBI公布的基因編碼序列一致的重組編輯型AZIN1慢病毒表達(dá)載體行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.4慢病毒的包裝制備293FT細(xì)胞在293FT專用培養(yǎng)基中培養(yǎng)。A液：取空載體和慢病毒包裝載體質(zhì)粒pLP1、pLP2、pLP VSV-G各5 μg加入1.5 mL Opti-MEM培養(yǎng)基；B液：取30 μL Lipofectamine2000加入1.5 mL Opti-MEM培養(yǎng)基，輕柔混合，室溫靜置5 min；將A液與B液混勻，室溫靜置20 min后加入細(xì)胞密度達(dá)80%～90%的293FT細(xì)胞培養(yǎng)基中，37 ℃孵育過夜后換液，轉(zhuǎn)染后48～72 h收集上清，即病毒液。野生型和編輯型AZIN1慢病毒的制備同上。

1.5穩(wěn)定感染的EC109細(xì)胞株的建立EC109細(xì)胞株在含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，細(xì)胞密度達(dá)30%～40%時(shí)吸去培養(yǎng)基，換為病毒液培養(yǎng)，加入polybrene(10 mg/L)促進(jìn)感染，4～8 h后更換為新鮮培養(yǎng)基，48 h后加入blasticidin(3 mg/L)篩選培養(yǎng)1周。

2　結(jié)果

2.1目的基因的擴(kuò)增將PCR產(chǎn)物送測序，選取測序結(jié)果中目標(biāo)位點(diǎn)的A峰與G峰均高且與NCBI公布的基因編碼序列一致的PCR產(chǎn)物(圖1)，行瓊脂糖凝膠電泳后得到目的片段大小約為1 347 bp(圖2)。

圖1　PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的序列色譜圖

1：DNA Marker；2：擴(kuò)增產(chǎn)物。圖2　AZIN1編碼序列RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

2.2重組慢病毒表達(dá)載體的鑒定重組慢病毒表達(dá)載體用BamH Ⅰ和XhoⅠ雙酶切獲得1 347 bp大小的AZIN1基因片段和6 915 bp大小的pLenti6/V5-D-TOPO開環(huán)慢病毒表達(dá)載體，與預(yù)期相符，見圖3。測序結(jié)果顯示，重組野生型AZIN1慢病毒表達(dá)載體插入片段與NCBI公布的基因編碼序列一致；重組編輯型AZIN1慢病毒表達(dá)載體插入片段除編輯位點(diǎn)為I外，其余序列與NCBI公布的基因編碼序列一致，見圖4。

1：DNA Marker；2～11：重組AZIN1慢病毒表達(dá)載體經(jīng)BamH Ⅰ和Xho Ⅰ雙酶切。圖3　重組AZIN1慢病毒表達(dá)載體的雙酶切鑒定

上：重組野生型AZIN1慢病毒表達(dá)載體；下：重組編輯型AZIN1慢病毒表達(dá)載體。圖4　重組AZIN1慢病毒表達(dá)載體的序列色譜圖

2.3穩(wěn)定感染的EC109細(xì)胞株的鑒定EC109細(xì)胞本身只表達(dá)野生型AZIN1。RT-PCR結(jié)果示穩(wěn)定感染野生型AZIN1和編輯型AZIN1慢病毒組在436 bp處的目的條帶均較深，而慢病毒對照組較淺，見圖5；測序結(jié)果見圖6；Western blot結(jié)果示穩(wěn)定感染野生型AZIN1和編輯型AZIN1慢病毒組AZIN1蛋白表達(dá)水平均高于慢病毒對照組，見圖7。

1、5：DNA Marker；2、6：慢病毒對照組；3、7：穩(wěn)定感染野生型AZIN1慢病毒組；4、8：穩(wěn)定感染編輯型AZIN1慢病毒組。圖5　穩(wěn)定感染的EC109細(xì)胞株的RT-PCR鑒定

上：慢病毒對照組；中：穩(wěn)定感染野生型AZIN1慢病毒組；下：穩(wěn)定感染編輯型AZIN1慢病毒組。圖6　穩(wěn)定感染的EC109細(xì)胞株的測序結(jié)果

1、4：慢病毒對照組；2、5：穩(wěn)定感染野生型AZIN1慢病毒組；3、6：穩(wěn)定感染編輯型AZIN1慢病毒組。圖7　穩(wěn)定感染的EC109細(xì)胞株的Western blot鑒定

3　討論

哺乳動物中最常見的RNA編輯類型A至I編輯是由具有雙鏈特異性的RNA腺苷脫氨酶家族的RNA編輯酶ADAR1和ADAR2催化[2]。敲除小鼠的ADAR1或者ADAR2基因可導(dǎo)致小鼠死亡，說明這些酶和正常的生理功能密切相關(guān)，為哺乳動物正常生長所必需[3-4]。ADARs能識別特定雙鏈RNA底物分子中的A并催化其水解脫氨成為I，從而產(chǎn)生新的遺傳密碼，是蛋白質(zhì)分子多樣性發(fā)生的重要機(jī)制[5-8]。AZIN1轉(zhuǎn)錄物的A→I編輯受到ADAR1的特異調(diào)控，導(dǎo)致位于β鏈15的AZIN1 第367位殘基發(fā)生絲氨酸-甘氨酸置換，引起構(gòu)象改變。在原發(fā)性肝癌中，編輯型AZIN1較野生型AZIN1具有更強(qiáng)的抗酶蛋白親和力，通過中和抗酶蛋白介導(dǎo)的鳥氨酸脫羧酶和細(xì)胞周期蛋白D1降解，促進(jìn)了細(xì)胞增殖[9]。既往研究[1]對69例食管鱗癌組織及其對應(yīng)的癌旁正常食管組織樣本進(jìn)行RNA編輯水平檢測，發(fā)現(xiàn)食管鱗癌組織中AZIN1的RNA編輯水平比對應(yīng)的癌旁正常食管組織升高，提示編輯型AZIN1可能在食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，編輯型AZIN1有可能是食管鱗癌診治的一個(gè)有潛力的新靶點(diǎn)。該實(shí)驗(yàn)成功制備了野生型和編輯型AZIN1的慢病毒并建立了穩(wěn)定感染的EC109細(xì)胞株，為進(jìn)一步的研究奠定了基礎(chǔ)。

[1]QIN YR,QIAO JJ,CHAN TH,et al.Adenosine-to-inosine RNA editing mediated by ADARs in esophageal squamous cell carcinoma[J].Cancer Res,2014,74(3):840

[2]VALENTE L,NISHIKURA K.ADAR gene family and A-to-I RNA editing: diverse roles in posttranscriptional gene regulation[J].Prog Nucleic Acid Res Mol Biol,2005,79:299

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(2015-10-26收稿責(zé)任編輯徐春燕)

Preparation of AZIN1 lentivirus and establishment of stable infected EC109 cell strain

CHENJinghong,CHANGZhiwei,JIAYongxu,QINYanru

DepartmentofOncology,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

AZIN1;RNA editing;lentivirus;EC109 cell

Aim: To prepare the lentivirus of the wild type and the edited type of AZIN1, and then establish stable infected EC109 cell strain. Methods: The cDNA came from human esophageal squamous cell carcinoma tissue was amplified by RT-PCR. The PCR products with high peak A and peak G in the target site and the gene coding sequence matching the NCBI published were chosen and inserted into lentiviral vector pLenti6/V5-D-TOPO to construct the recombinant lentiviral vectors of the wild type and the edited type of AZIN1.The recombinant lentiviral vectors were verified with restriction enzyme digestion and DNA sequencing. Then the lentivirus were packed in 293FT cells and collected to infect EC109 cells. The stable infected EC109 cell strain was identified by RT-PCR,sequencing and Western blot. Results: By restriction enzyme digestion, the recombinant lentiviral vectors were digested into fragments of 1 347 bp and 6 915 bp. DNA sequencing results showed that the 1 347 fragments were the right gene coding sequence of AZIN1.The results of RT-PCR,sequencing and Western blot showed that the stable infected EC109 cell strain was established successfully. Conclusion: The lentivirus of the wild type and the edited type of AZIN1 and the stable infected EC109 cell strain have been constructed successfully.

10.13705/j.issn.1671-6825.2016.05.001

，女，1964年1月生，博士，主任醫(yī)師，教授，研究方向：消化道腫瘤基礎(chǔ)與臨床，E-mail:yanruqin@163.com

*國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目81472605

R735.1