hUC-MSCs和白藜蘆醇對AD小鼠學習記憶能力及腦內SIRT1信號通路的影響*

王欣欣，馬珊珊，孟　楠，邢　衢，黃團結，程　康，楊　波，關方霞1,#

1)鄭州大學第一附屬醫院干細胞研究室 鄭州 450052　2)鄭州大學生命科學院干細胞研究室 鄭州450001

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hUC-MSCs和白藜蘆醇對AD小鼠學習記憶能力及腦內SIRT1信號通路的影響*

王欣欣1)，馬珊珊2)，孟楠1)，邢衢2)，黃團結2)，程康2)，楊波1)，關方霞1,2)#

1)鄭州大學第一附屬醫院干細胞研究室 鄭州 4500522)鄭州大學生命科學院干細胞研究室 鄭州450001

白藜蘆醇；人臍帶間充質干細胞；阿爾茨海默癥；SIRT1；小鼠

目的：探討人臍帶間充質干細胞(hUC-MSCs)移植聯合白藜蘆醇(RES)灌胃對AD小鼠學習記憶能力的影響及對腦內SIRT1信號通路的調控作用。方法：40只AD小鼠隨機分為AD組、hUC-MSCs組、RES組、hUC-MSCs聯合RES組(聯合組)，每組10只。干預8周后，用Morris水迷宮評估小鼠學習記憶能力；取小鼠腦組織，采用免疫組化法檢測Nestin的表達，TUNEL檢測神經細胞凋亡，qRT-PCR檢測神經營養因子BDNF、NGF和NT-3 mRNA的表達水平，Western blot法檢測SIRT1、PCNA、P53、P21和P16的表達。結果：hUC-MSCs與RES均可使AD小鼠逃避潛伏期縮短，穿越平臺次數增多，目的象限停留時間增加；海馬區再生細胞增多，凋亡細胞減少，BDNF、NGF和NT-3 mRNA表達水平升高，SIRT1和PCNA蛋白的表達增強，P53、P21、P16蛋白的表達減弱(P<0.05)。 hUC-MSCs和RES聯合對AD小鼠學習記憶能力、神經細胞再生、BDNF以及SIRT1蛋白的表達具有協同作用(P<0.05)。結論：hUC-MSCs移植和RES灌胃可能通過調控腦內SIRT1信號通路共同促進AD小鼠學習記憶能力的改善。

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)是一種與年齡相關的中樞神經系統退行性變，臨床主要表現為認知能力下降，病理學表現為腦內淀粉樣沉積和纖維樣纏繞[1],目前仍無有效的干預措施。間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)能分泌多種神經營養因子并具有神經分化的潛能，在神經損傷、神經退行性變動物模型中發揮神經保護作用[2]。作者所在的課題組前期研究[3]發現MSCs移植可改善AD鼠的學習記憶能力且無明顯副作用，為治療AD提供了新途徑。白藜蘆醇(resveratrol,RES)是一種存在于葡萄等植物中的多酚類化合物，能通過激活SIRT1發揮抗衰老、保護神經和延長壽命的作用[4]，并能夠促進脂肪間充質干細胞的生存，調控骨髓間充質干細胞的神經分化[5-6]。但是，RES是否能協同人臍帶間充質干細胞(human umbilical cord derived MSCs,hUC-MSCs)移植治療AD尚不明確。該研究采用hUC-MSCs移植聯合RES灌胃干預AD小鼠，觀察AD鼠行為學和組織學改善，并探討SIRT1信號通路的介導作用。

1　材料與方法

1.1材料新生兒臍帶來自鄭州大學第一附屬醫院婦產科(產婦簽署知情同意書)，經分離、原代細胞培養傳代得到第4代(P4) hUC-MSCs用于移植。DMEM/F12培養基購自寶信生物科技有限公司，胎牛血清購自美國Gemini公司，RES購自美國Sigma公司，DNA小提試劑盒、Trizol、逆轉錄試劑盒、qRT-PCR試劑盒購自TaKaRa公司，抗體購自Santa Cruz公司，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，TUNEL原位細胞凋亡檢測試劑盒購自南京建成生物公司，SP二步法免疫組化二抗試劑盒、DAB染色試劑盒、蘇木精購于武漢博士德生物工程有限公司。APP695V717I轉基因小鼠購自中國協和醫科大學動物所。

1.2APP轉基因小鼠的鑒定、分組與處理APP695V717I轉基因小鼠具有腦內APP過表達的特點，可模擬AD。剪取鼠尾約0.5 cm，提取DNA，進行PCR擴增，APP引物: 5’-CCCTGAACCTGAAA CATAAAAT-3’(上游引物)和5’-GCTACGAAAATC CAACCTACAA-3’ (下游引物)，瓊脂糖凝膠電泳鑒定。將經鑒定確認為APP+的小鼠隨機分為4組，每組10只，分別為:AD組(APP+小鼠), hUC-MSCs組 (尾靜脈移植 P4 hUC-MSCs 5×106mL-1，0.2 mL/只), RES組[RES灌胃200 mg/(kg·d)], RES+MSC組(hUC-MSC移植聯合RES灌胃)。8周后進行以下指標的檢測。

1.3Morris水迷宮檢測小鼠學習記憶能力水迷宮水池直徑1.2 m，平臺直徑10 cm，位于水池第一象限，離液面1 cm。訓練階段，小鼠首先于平臺上停留10 s以熟悉環境，然后從不同象限固定位置入水，若小鼠60 s內未找到平臺，將其引至平臺停留10 s再進行下一象限實驗。連續訓練5 d，3次/d，第6天開始進行空間探索實驗，撤去平臺，分別從4個象限固定位置入水，用攝像采集系統捕獲小鼠游泳軌跡，統計穿越平臺次數、逃避潛伏期和平臺所在象限停留時間等參數。

1.4免疫組化檢測小鼠腦組織Nestin蛋白的表達

1.5TUNEL檢測小鼠神經細胞凋亡取3只小鼠，處死取腦組織。石蠟切片經二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水， 0.01 mol/L枸櫞酸微波修復、冷卻后，用含TdT酶和FITC 標記的dUTP的反應液37 ℃孵育60 min(陰性對照組反應液中不含TdT酶)，PBS清洗3次，DAPI染核10 min，PBS清洗3次，熒光顯微鏡下觀察拍照。用Image J軟件進行陽性細胞計數。

1.6qRT-PCR檢測小鼠腦內神經營養因子(BDNF、NGF、NT-3)mRNA的表達Trizol裂解法提取腦組織總RNA，測RNA濃度和純度后，逆轉錄合成cDNA。反應體系：SYBR Premix Ex TaqⅡ 10 μL，ROX Reference DyeⅡ 2 μL,cDNA 0.4 μL,上下游引物各0.8 μL，dH2O 6 μL。反應條件：90 ℃ 5 min,90 ℃ 30 s,60 ℃ 34 s,40個循環。采用7500 Fast PCR儀進行擴增，獲得Ct值，采用2-ΔΔCt計算目的基因的表達水平。BDNF、NGF、NT-3及內參GAPDH基因引物序列及產物片段長度見表1。

表1　實時熒光定量PCR引物序列及產物片段長度

1.8統計學處理采用SPSS 19.0處理數據。應用析因設計的方差分析探討MSC移植和RES灌胃對水迷宮實驗結果、Nestin+和TUNEL+細胞數、腦組織神經營養因子mRNA和SIRT1信號通路相關蛋白表達的影響，檢驗水準α=0.05。

2　結果

2.1hUC-MSCs移植和RES灌胃對AD小鼠水迷宮測試結果的影響結果見表2。

2.2hUC-MSCs移植和RES灌胃對AD小鼠海馬組織Nestin+細胞數及神經細胞凋亡的影響結果見表3。

2.3hUC-MSCs移植和RES灌胃對AD小鼠腦組織神經營養因子mRNA表達的影響結果見表4。

表2　4組小鼠水迷宮測試結果

表3　4組小鼠海馬組織中Nestin+、凋亡神經細胞計數

表4　4組小鼠腦組織神經營養因子mRNA表達水平的比較

2.4hUC-MSCs移植和RES灌胃對AD小鼠腦內SIRT1信號通路相關蛋白表達水平的影響結果見表5。

表5　4組小鼠腦組織中SIRT1信號通路相關蛋白表達水平比較

3　討論

該研究結果顯示，hUC-MSCs移植或RES灌胃能改善AD小鼠學習記憶能力，促進AD小鼠腦組織神經營養因子BDNF、NGF、NT-3 mRNA的表達,并能促進內源性神經再生(Nestin+細胞增多)，減少細胞凋亡(TUNEL+細胞減少)。此外，有研究[7]提出，移植的干細胞可整合到神經系統替代受損細胞，因此該實驗中移植的hUC-MSCs在AD小鼠腦內的存活與分化狀況尚需進一步研究。

分子水平上，hUC-MSCs移植與RES灌胃均能上調小鼠腦組織SIRT1信號通路相關因子如SIRT1、PCNA蛋白的表達，下調P53、P21和P16蛋白的表達。 PCNA表達增高在一定程度上反映了神經再生增強，因為PCNA是一種S期細胞增殖的標志物[8]。P53表達增高與神經元凋亡和退化相關[9]，AD鼠治療后P53蛋白表達下降，提示神經凋亡減少。p53-p21是調控衰老的重要信號[10]，p16也是與衰老密切相關的基因[11]，而且其表達受SIRT1基因影響[12]。該研究中RES灌胃和hUC-MSCs移植治療后AD小鼠腦組織SIRT1增加伴隨著P53、P21和P16蛋白表達減少，提示抗衰老作用增強。因此，SIRT1及相關因子PCNA、 P53、 P21和P16的改變可能是hUC-MSCs和RES治療AD的分子機制。

另外，hUC-MSCs移植和RES灌胃聯合對AD鼠學習記憶能力、神經細胞再生、BDNF以及SIRT1蛋白的表達具有協同作用。

綜上所述，RES和hUC-MSCs作用于AD小鼠可協同促進神經再生，抑制神經凋亡，提高學習記憶能力。RES灌胃聯合hUC-MSCs移植有望成為一種更有效的AD治療手段。

[1]LIGGINS C,SNYDER HM,SILVERBERG N,et al.International Alzheimer′s Disease Research Portfolio(IADRP) aims to capture global Alzheimer′s disease research funding[J].Alzheimers Dement,2014,10(3):405

[2]COLPO GD, ASCOLI BM, WOLLENHAUPT-AGUIAR B, et al. Mesenchymal stem cells for the treatment of neurodegenerative and psychiatric disorders[J]. An Acad Bras Cienc, 2015, 87(2 Suppl):1435

[3]孟楠，馬珊珊，王欣欣，等. 氯化鋰聯合 hUC-MSCs 移植對阿爾茨海默病小鼠的治療作用[J].鄭州大學學報(醫學版),2015,51(2):157

[4]REHAN L,LASZKI-SZCZACHOR K,SOBIESZCZANSKA M,et al.SIRT1 and NAD as regulators of ageing[J].Life Sci,2014,105(1/2):1

[5]SIMIC P,ZAINABADI K,BELL E,et al.SIRT1 regulates differentiation of mesenchymal stem cells by deacetylating β-catenin[J].EMBO Mol Med,2013,5(3):430

[6]YUAN HF,ZHAI C,YAN XL,et al.SIRT1 is required for long-term growth of human mesenchymal stem cells[J].J Mol Med(Berl),2012,90(4):389

[7]LEE JK,JIN HK,ENDO S,et al.Intracerebral transplantation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells reduces amyloid-beta deposition and rescues memory deficits in Alzheimer′s disease mice by modulation of immune responses[J].Stem Cells,2010,28(2):329

[8]YANG Y,MUFSON EJ,HERRUP K.Neuronal cell death is preceded by cell cycle events at all stages of Alzheimer′s disease[J].J Neurosci,2003,23(7):2557

[9]DORSZEWSKA J,OCZKOWSKA A,SUWALSKA M,et al.Mutations in the exon 7 of Trp53 gene and the level of p53 protein in double transgenic mouse model of Alzheimer′s disease[J].Folia Neuropathol,2014,52(1):30

[10]SCACCHI R,GAMBINA G,MORETTO G,et al.P21 gene variation and late-onset Alzheimer′s disease in the Italian population[J].Dement Geriatr Cogn Disord,2013,35(1/2):51

[11]OVERHOFF MG,GARBE JC,KOH J,et al.Cellular senescence mediated by p16INK4A-coupled miRNA pathways[J].Nucleic Acids Res,2014,42(3):1606

[12]SIMPSON JE,INCE PG,MATTHEWS FE,et al.A neuronal DNA damage response is detected at the earliest stages of Alzheimer′s neuropathology and correlates with cognitive impairment in the Medical Research Council′s Cognitive Function and Ageing Study ageing brain cohort[J].Neuropathol Appl Neurobiol,2015,41(4):483

(2015-10-29收稿責任編輯徐春燕)

Effects of hUC-MSCs and resveratrol on learning and memory capability and SIRT signaling pathway in brain tissue of AD mice

WANGXinxin1)，MAShanshan2),MENGNan1)，XINGQu2),HUANGTuanjie2),CHENGKang2),YANGBo1)，GUANFangxia1,2)

1)StemCellLaboratory,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500522)StemCellLaboratory,SchoolofLifeSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001

resveratrol;human umbilical cord derived mesenchymal stem cell; Alzheimer′s disease;SIRT1;mouse

Aim: To investigate the effects of human umbilical cord derived mesenchymal stem cells(hUC-MSCs) transplantation and resveratrol(RES) gavage on the cognition of AD mice and SIRT1 signaling pathway in brain tissue. Methods: Forty AD mice were randomly allocated into AD group, hUC-MSCs group, RES group and hUC-MSCs combined with RES group(combined group). Eight weeks after intervention, Morris water maze was employed to evaluate the learning and memory capability; the brain tissue was prepared, immunohistochemistry was used to detect the expression of Nestin, TUNEL was used to detect cell apoptosis, qRT-PCR was used to examine the expressions of neurotropic factors BDNF, NGF and NT-3 mRNA,and Western blot was used to examine the expressions of SIRT1, PCNA, P53, P21 and P16 protein.Results: hUC-MSCs and RES could improve learning and memory capability, as evidenced by shorter latency, more crosses and time spent in the target quadrant in the Morris water maze; hUC-MSCs and RES could both enhance hippocampus neurogenesis,alleviate apoptosis,upregulate the expressions of BDNF, NGF and NT-3 mRNA as well as enhance the expressions of SIRT1 and PCNA and inhibit the expressions of P53, P21 and P16. Furthermore, hUC-MSCs and RES exerted synergistic effects on the learning and memory capability,regeneration of neuronal cells as well as upregulated the expressions of BDNF and SIRT1. Conclusion: hUC-MSCs transplantation and RES gavage could synergistically improve learning and memory capability of AD mice via regulating SIRT1 signaling pathway.

10.13705/j.issn.1671-6825.2016.05.005

*國家自然科學基金資助項目81471306，U1404313；河南省高校科技創新團隊支持計劃15IRTSTHN022；河南省科技創新人才計劃 154200510008;河南省高等學校重點科研項目計劃17A310012；高等學校博士學科點專項科研基金資助課題20114101110004

，女，1969年2月生，博士，教授，研究方向：干細胞與再生醫學， E-mail:guanfangxia@126.com

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