HepG2細胞中CYP3A、SLCO1B1和POR基因型檢測*

趙云龍，楊衛紅，張莉蓉

1)鄭州大學基礎醫學院法醫學系 鄭州 450001　2)焦作市第二人民醫院病理科 焦作 454001　3)鄭州大學基礎醫學院藥理學系 鄭州 450001

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HepG2細胞中CYP3A、SLCO1B1和POR基因型檢測*

趙云龍1，2)，楊衛紅1)，張莉蓉3)#

1)鄭州大學基礎醫學院法醫學系 鄭州 4500012)焦作市第二人民醫院病理科 焦作 4540013)鄭州大學基礎醫學院藥理學系 鄭州 450001

HepG2；CYP3A；SLCO1B1；POR;單核苷酸多態性

目的：檢測HepG2細胞中CYP3A、SLCO1B1、POR的單核苷酸多態性(SNP)位點CYP3A4*1G、CYP3A4*22、CYP3AP1*3、CYP3A5*3、SLCO1B1 T521C、SLCO1B1 A388G、POR*28的基因型。方法：從HepG2細胞中提取基因組DNA，PCR擴增目的片段，對PCR擴增產物測序后分析上述7個多態性位點的基因型。結果與結論：CYP3A4*1G、CYP3A4*22、CYP3AP1*3、CYP3A5*3、SLCO1B1 T521C、SLCO1B1 A388G、POR*28的基因型分別為GA、CC、GA、AG、TC、AG、CC。CYP3A4*1G下游596 bp處基因型為CT，SLCO1B1 T521C下游50 bp和76 bp處基因型分別為TC和CT，POR*28下游281 bp處基因型為GA。

*國家自然科學基金項目81173127；河南省杰出青年基金項目074100510020；河南省教育廳基礎研究項目13A310663；河南省科技廳基礎與前沿技術研究計劃項目142300410206

藥物代謝酶CYP3A(主要由CYP3A4和CYP3A5組成)在成人肝臟中含量豐富，可代謝50%左右的臨床常用處方藥物[1]，因而多年來一直是科研工作者研究的熱點之一。CYP3A基因單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism,SNP)是影響該酶表達與活性的主要因素[2]。到目前為止，研究[3-8]結果表明CYP3A基因中CYP3A4*1G(rs2242480)、CYP3A4*22(rs35599367)、CYP3AP1*3(rs2177180)、CYP3A5*3(rs776746)可影響CYP3A4或CYP3A5的表達和活性，進而影響阿托伐他汀、芬太尼、辛伐他汀、他可莫司等藥物的療效。另外，SLCO1B1 T521C(rs4149056)、SLCO1B1 A388G(rs2306283)和POR*28(rs1057868)多態性也與常用臨床藥物的療效相關[6,9-10]。體外實驗[11]證實CYP3A4內含子10可影響CYP3A4的表達，并且被該內含子中的CYP3A4*1G所調控。同時，CYP3A4*1G增強CYP3A4基因表達的作用受到附近抑制元件的負調控[12]。

HepG2細胞是研究藥物代謝酶最常用的一種細胞株，目前尚未有研究對HepG2細胞中上述7個SNP位點進行基因分型。該研究目的是對HepG2細胞中的上述基因位點進行分型，采集最基本的遺傳資料，為將來從內含子和假基因角度進一步闡明CYP3A酶活性個體差異的機制、指導臨床個體化用藥提供理論基礎。

1　材料與方法

1.1材料HepG2細胞株(上海中科院細胞研究所)；基因組DNA提取試劑盒(QIAGEN公司產品)，PCR試劑盒(TaKaRa公司產品)，PCR擴增儀(德國Biometra公司產品)，水平電泳槽(美國Bio-Rad公司產品)，凝膠成像分析系統(美國Syngene公司產品)。

1.2DNA提取用DNA提取試劑盒按說明書從培養的HepG2細胞中提取DNA。

1.3目的片段的擴增PCR擴增目的片段所用引物來自參考文獻[8-9,13-14]。CYP3A4*1G、CYP3A4*22、CYP3AP1*3、CYP3A5*3、SLCO1B1 T521C、 SLCO1B1 A388G、POR*28所用引物序列及相關信息見表1。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳初步驗證后送立菲生物技術有限公司測序，將測序結果與NCBI上預期序列進行比對。

表1　所用引物及相關信息

F：上游引物，R：下游引物。

2　結果

測序結果見圖1～4，其中出現的SNP相關信息見表2。結果表明HepG2細胞中CYP3A4*1G、CYP3AP1*3、SLCO1B1 T521C、CYP3A5*3、SLCO1B1 A388G均為突變型雜合子；CYP3A4*22、POR*28為野生型純合子。

另外，對比測序結果發現：在CYP3A4內含子10中，位于CYP3A4*1G位點下游596 bp處有一SNP rs4646440(C→T)存在，是CT基因型，為突變雜合子，見圖1B；POR*28位點下游281 bp處有一SNP rs1057870(G→A)存在，是GA基因型，為突變雜合子，見圖2C；SLCO1B1 T521C位點下游50 bp處有一SNP rs4149057(T→C)存在，是TC基因型，為突變雜合子，見圖3B；SLCO1B1 T521C位點下游76 bp處，有一SNP rs2291075(C→T)存在，是CT基因型，為突變雜合子，見圖3C。

A：CYP3A4*1G為GA基因型；B：CYP3A4*1G下游596 bp處SNP為CT基因型。圖1　CYP3A4*1G PCR產物測序結果

A：CYP3A5*3為AG基因型；B：POR*28為CC基因型；C：POR*28下游281 bp處SNP為GA基因型。圖2　CYP3A5*3與POR*28 PCR產物測序結果

A：TC基因型；B/C：SLCO1B1 T521C下游50/76 bp處SNPs為TC/CT基因型。圖3　SLCO1B1 T521C PCR產物測序結果

A：CYP3AP1*3；B：CYP3A4*22；C：SLCO1B1 A388G。圖4　CYP3AP1*3、CYP3A4*22、SLCO1B1 A388G PCR產物測序結果

表1　測序中出現的SNP及相關信息

染色體數據來自http://www.ncbi.nlm.nih.gov。

3　討論

與代謝相關的SNP的功能分析一直是研究的熱點，有文獻[5]報道CYP3A4*1G遺傳多態性可降低CYP3A活性，使芬太尼代謝減慢。 CYP3A5*3可降低腎移植受體他克莫司代謝速率[15]，CYP3A5*3聯合CYP3AP1*3可能降低肝臟活性代謝物的水平，并最終降低阿托伐他汀的降脂作用[8]。CYP3A4*22能夠明顯降低CYP3A4 mRNA的表達，降低辛伐他汀的代謝[6]，減少他克莫司的清除[16]。POR*28能夠提高CYP3A4酶活性，降低阿托伐他汀降總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇的效應[17]。SLCO1B1 T521C能夠明顯減弱普伐他汀降低密度脂蛋白膽固醇的效應[18]，能夠降低甲氨蝶呤的代謝[19-21]。SLCO1B1 A388G可提高阿托伐他汀治療高膽固醇血癥、升高密度脂蛋白的效應[22]。但這些研究大多集中于體內，而這種體內研究往往受多種不可控因素影響，難以將機制研究進行下去，甚至有可能得出截然相反的結論。

近年來基因組編輯在研究DNA片段的作用機制及其與疾病和治療的關系方面起著舉足輕重的作用[23-24]。為探求與CYP3A基因表達有關的遺傳生物標志物并從基因組水平闡明其機制，作者將選取在肝臟藥物代謝酶研究中常用的HepG2細胞為研究對象，對CYP3A基因進行編輯。為此，此次試驗對影響CYP3A表達的SNP位點進行了基因型分析，以期為將來的基因組編輯研究提供遺傳背景信息。該研究發現，HepG2細胞中POR*28和CYP3A4*22均為野生型純合子；POR*28位點下游281 bp的rs1057870為突變雜合子，是同義突變；而CYP3A4*1G、CYP3AP1*3和CYP3A5*3為突變型雜合子，可作為后續對照研究的中間體；位于CYP3A4*1G下游596 bp的SNP rs4646440為突變雜合子，位于增強子區[25]，其具體情況不明，可用基因組編輯的方法進一步研究。除檢測影響CYP3A表達的位點之外，該研究也對HepG2細胞中與藥物轉運有關的轉運體的基因多態性位點進行了分析，結果表明，SLCO1B1 T521C、SLCO1B1 A388G均為突變型雜合子；位于SLCO1B1 T521C位點下游的rs4149057和rs2291075為突變雜合子，均為同義突變。

該研究結果提示：在清晰的遺傳背景下，采用CRISPR/Cas9技術在HepG2細胞中進行基因敲除或定點突變，可用于研究CYP3A4內含子10、CYP3A4*1G、CYP3AP1*3及CYP3A4*22的功能，這將有效地定向排除體內研究所存在的其他干擾因素的影響，從而得出更具說服力的結論，同時也為研究SNP功能開辟了新的途徑。

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(2015-11-28收稿責任編輯王曼)

Genotype analysis of CYP3A, SLCO1B1 and POR in HepG2 cells

ZHAOYunlong1，2),YANGWeihong1),ZHANGLirong3)

1)DepartmentofForensicMedicine,CollegeofBasicMedicalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500012)DepartmentofPathology,theSecondPeople′sHospitalofJiaozuoCity,Jiaozuo4540013)DepartmentofPharmacology,CollegeofBasicMedicalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001

HepG2;CYP3A;SLCO1B1;POR;single necleotide polymorphism

Aim: To detect the single nucleotide polymorphism(SNP) of drug metabolic enzyme CYP3A, transporter SLCO1B1 and cytochrome P450 oxidoreductase(POR) including CYP3A4*1G, CYP3A4*22, CYP3AP1*3, CYP3A5*3, SLCO1B1 T521C, SLCO1B1 A388G and POR*28 in HepG2 cells．Methods: Genome DNA was obtained from HepG2 cells. Target gene segments were amplified by PCR. Then the genotype of the 7 alleles mentioned above were detected by sequencing the amplification products. Results and Conclusion: The genotypes of CYP3A4*1G, CYP3A4*22, CYP3AP1*3, CYP3A5*3, SLCO1B1 T521C, SLCO1B1 A388G, POR*28 were GA, CC, GA, AG, TC, AG, and CC, respectively. Besides, the genotypes of SNP located 596 bp downstream of CYP3A4*1G, those located 50 bp and 76 bp downstream of SLCO1B1 T521C, 281 bp downstream of POR*28 were CT, TC, CT, and GA, respectively.

10.13705/j.issn.1671-6825.2016.05.007

，女，1964年10月生，博士，教授，研究方向：藥物基因組學，E-mail:zhanglirongzzu@126.com

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