河南省商丘市艾滋病抗病毒治療病毒未抑制患者HIV-1耐藥毒株的變異*

袁　源，劉宏偉#，劉春華，王　哲，阮玉華，邢　輝

1)河南省疾病預防控制中心性病艾滋病研究所 鄭州 450016　2)中國疾病預防控制中心性病艾滋病預防控制中心 北京 100050

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河南省商丘市艾滋病抗病毒治療病毒未抑制患者HIV-1耐藥毒株的變異*

袁源1)，劉宏偉1)#，劉春華1)，王哲1)，阮玉華2)，邢輝2)

1)河南省疾病預防控制中心性病艾滋病研究所 鄭州 4500162)中國疾病預防控制中心性病艾滋病預防控制中心 北京 100050

人類免疫缺陷病毒；耐藥；抗病毒治療；基因突變；河南省

目的：了解河南省商丘市艾滋病一線抗病毒治療病毒未抑制患者HIV-1耐藥毒株的變異。方法：采集河南省商丘市一線抗病毒治療大于6個月、病毒未抑制的艾滋病患者血樣231份，提取RNA，通過逆轉錄及巢式PCR擴增HIV-1 pol區基因，所得擴增片段進行測序后提交斯坦福大學HIV耐藥數據庫進行基因型耐藥性分析。結果：在231份樣本中，229份擴增并測序成功，共獲得229例患者蛋白酶區和逆轉錄酶區的基因擴增片段。針對非核苷類逆轉錄酶抑制劑(NNRTIs)、核苷類逆轉錄酶抑制劑(NRTIs)和蛋白酶抑制劑(PIs)，分別有185例(80.79%)、150例(65.50%)和3例(1.31%)發生耐藥性突變，針對上述各抑制劑發生最多的耐藥性突變分別為K103N/S 45.42%(104/229)、M184I/V 43.67%(100/229)和M46I 0.87%(2/229)，其中與病毒載量5～ lg拷貝/mL相比，M184I/V耐藥性突變在患者體內病毒載量3～拷貝/mL時更易出現(OR=0.283，95%CI為0.136～0.592，P<0.001)，與治療時間6～個月相比，K103N/S耐藥性突變在患者治療時間48～個月時更易出現(OR=7.422，95%CI為1.637～33.651，P<0.001)，K65R突變位點在使用含D4T一線抗病毒治療方案患者中發生率較高(P=0.044)。結論：河南省商丘市抗病毒治療病毒未抑制人群中耐藥性突變位點多、類型復雜，應根據耐藥突變情況選用更適合的抗病毒起始治療方案，以減少耐藥毒株的產生。

高效抗逆轉錄病毒治療(HAART)方法可有效地抑制HIV感染者體內病毒復制，明顯降低患者的病死率，延長患者的生存期。但如果產生了耐藥，病毒復制不能有效地控制，就會導致臨床上抗病毒治療的失敗[1]。河南省是我國最早實施HAART的省份之一，初始抗病毒治療方案為2種核苷類逆轉錄酶抑制劑(NRTI)+1種非核苷類逆轉錄酶抑制劑(NNRTI)的一線抗病毒治療方案。隨著抗病毒治療時間的持續，HIV-1耐藥毒株變異不可避免會發生。為了解河南省HIV-1耐藥毒株變異的情況，作者選取商丘市一線抗病毒治療病毒未抑制的患者進行了HIV-1基因型耐藥性的檢測與研究，為指導后續二線抗病毒治療、制定有效抗病毒治療方案提供依據。

1　對象與方法

1.1對象河南省商丘市重點縣一線抗病毒治療大于6個月，病毒未抑制(病毒載量≥3 lg拷貝/mL)的艾滋病患者231例，年齡18～68(45.3±9.1)歲，男124例，女107例，接受治療時間8.3～73.3(53.6±14.1)個月，調查時病毒載量為3.31～6.55(4.45±0.75)lg拷貝/mL。采集患者的靜脈血，經乙二胺四乙酸三鉀(EDTA-3K)抗凝后，于6 h內經3 000×g離心10 min分離血漿，分裝后凍存于-80 ℃用于基因型耐藥的檢測。

1.2病毒載量檢測使用Abbott m2000 RealTime HIV-1全自動實時熒光定量病毒載量檢測系統(美國Abbott公司)檢測血漿HIV病毒載量，最小檢測值1.602 lg拷貝/mL。

1.3基因型耐藥性檢測

1.3.1巢式PCR擴增采用RNA提取試劑盒(德國Qiagen公司)，從待檢血漿中抽提病毒RNA。以提取的RNA為模板，進行逆轉錄和巢式PCR擴增。先用一步RT-PCR方法完成逆轉錄和第一輪PCR(TaKaRa One Step RNA PCR Kit試劑盒，大連寶生物公司)，再以第一輪PCR產物為模板進行第二輪PCR[2]。PCR擴增產物大小為1 300 bp，10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，切下目的片段，用QIAamp膠回收試劑盒(德國Qiagen公司)進行回收，回收產物用上海Invitrogen生物技術有限公司ABI 377全自動DNA測序儀雙脫氧終止法測序。

1.3.2序列拼接與分析用ContigExpress軟件將核苷酸序列拼接、校對后，得到包括蛋白酶區1～99氨基酸和逆轉錄酶區1～300氨基酸的pol基因區序列，提交美國斯坦福大學HIV耐藥數據庫(http://hivdb.stanford.edu/pages/algs/sierra_sequence.html)進行比對,確定耐藥性突變位點和對各種抗病毒藥物的耐受程度。針對每種藥物給出評分，分為低度(15～分)、中度(30～分)和高度(60～分)，低度及以上耐藥即為基因型耐藥。

1.4統計學處理應用SAS 9.2進行分析，對所得到的HIV-1耐藥基因突變頻率和位點與艾滋病患者的病毒載量、治療時間的關系進行單因素logistic回歸分析，抗病毒治療方案與HIV-1耐藥突變發生的關系分析Fisher精確概率法。檢驗水準α=0.05。

2　結果

2.1抗病毒治療病毒未抑制患者情況分析共收集抗病毒治療病毒未抑制HIV患者231例， 229例患者的樣本擴增成功，獲得229例患者蛋白酶區和逆轉錄酶區的基因擴增片段。229例患者中53.71%(123/229)為男性，99.56%(228/229)為漢族，年齡18～68(45.3±9.3)歲，感染途徑主要以血液傳播為主，占92.58%(212/229)。患者接受治療時間為8.26～73.29(53.70±14.02)個月，調查時病毒載量為3.31～6.55(4.45±0.75)lg拷貝/mL。初始抗病毒治療方案全部為2種NRTI+1種NNRTI的一線抗病毒治療方案，其中71.62%(164/229)為齊多夫定(AZT)/司他夫定(D4T)+去羥肌苷(DDI)+奈韋拉平(NVP)/依非韋倫(EFV)，22.71%(52/229)為AZT/D4T+拉米夫定(3TC)+ NVP/EFV，5.67%(13/229)為其他抑制劑組成的抗病毒治療方案。

2.2HIV-1耐藥基因突變發生情況分析成功完成HIV-1耐藥基因檢測的229例患者中，有187例患者檢測出耐藥性突變位點，其中針對NNRTI發生耐藥性突變的有80.79%(185/229)，發生突變的位點有13個，主要的耐藥性突變為K103N/S 45.42%(104/229)、Y181C 31.00%(71/229)、G190A/S 20.52%(47/229)；對NRTI發生耐藥性突變的有65.50%(150/229)，發生突變的位點有16個，主要的耐藥性突變為M184I/V 43.67%(100/229)、≥1個胸苷類似物相關突變(TAMs) 42.79%(98/229)、T215F/Y 31.88%(73/229)；針對蛋白酶抑制劑(PIs)發生耐藥性突變的有1.31%(3/229)，發生突變的位點較少只有4個，分別為M46I 2例、I54I/V 1例、G73S 1例、N88S 1例。

2.3病毒載量與HIV-1耐藥性突變發生的關系 在檢測出的耐藥性突變位點中發現，M184I/V突變位點在病毒載量3～、4～、5～ lg拷貝/mL的患者中的發生率分別為56.76%(24/74)、43.75%(42/96)、27.12%(16/59)，單因素logistic回歸分析結果顯示當患者病毒載量5～ lg拷貝/mL時，發生M184I/V突變的比例比病毒載量3～ lg拷貝/mL時發生的比例下降(表1)。

表1　抗HIV病毒治療病毒未抑制患者體內病毒載量與M184I/V突變發生的關系

2.4抗病毒治療時間與HIV-1耐藥性突變發生的關系 在檢測出的耐藥性突變位點中發現，K103N/S突變位點在患者治療時間6～個月、24～個月及48～個月時的發生率分別為27.27%(15/55)、34.04%(16/47)、57.48%(73/127)，單因素logistic回歸分析結果顯示當患者治療時間48～個月時比治療時間6～個月的患者發生K103N/S突變的危險性增加(表2)。

表2　抗HIV病毒治療病毒未抑制患者治療時間與K103N/S突變發生的關系

2.5抗病毒治療方案與HIV-1耐藥突變發生的關系K65R突變位點在使用含D4T一線抗病毒治療方案患者中的發生率為7.14%(3/42)，比使用非D4T 一線抗病毒治療方案1.07%(2/187)發生率高(P=0.044)。

3　討論

該次調查的231例一線抗病毒治療病毒未抑制患者中，除2例未擴增成功外，其余229例均擴增并測序成功，總耐藥率為81.66%(187/229)，雖然接近南非83.5%的病毒抑制失敗患者中的耐藥率[3]，但高于福建省61.3%的耐藥率[4]，這可能與患者抗病毒治療時間長(超過一半患者治療時間大于4 a)，且使用易發生耐藥的含DDI的一線抗病毒治療方案有關[5]。

該調查結果顯示，針對NNRTI發生的耐藥性突變占主導地位，有185例(80.97%)患者出現了對NNRTI的耐藥性突變，高于對NRTI(65.50%)和PI (1.31%)的耐藥性突變，這與以往河南省抗病毒治療(DDI+AZT+NVP)人群耐藥性調查[6]相符。在出現針對NNRTI的耐藥性突變較多的位點中，發生頻率超過20%的突變為K103N/S、Y181C、G190A/S，其中K103N/S出現頻率最高，這可能與河南省的流行B亞型和含NVP或EFV的治療方案有關。研究[7]顯示K103N的突變在整個B亞型的發生率是40%，是臨床上最重要的NNRTI耐藥突變，它可造成大多數可用NNRTI藥物20～50倍的耐藥[8]。同時在分析抗病毒治療時間與耐藥突變位點的關系中，發現K103N/S突變出現的頻率與治療時間有關，在治療時間48～個月時K103N突變發生的危險性超過治療時間6～個月患者的3.603倍，這可能與此耐藥突變隨治療時間延長而累積有關。

229例患者中，針對NRTI的M184I/V耐藥突變出現的頻率在所有耐藥突變中排在第2位，有104例(43.67%)；同時它也是針對NRTI發生耐藥突變最多的位點，其次是≥1個TAMs(42.79%)和T215F/Y(31.88%)。且在多項耐藥調查[9-10]中出現，M184I/V出現頻率排在前列。M184I/V突變出現后可在幾周內就取代野生株產生對3TC和FTC的高度耐藥，導致含3TC抗病毒治療方案的失敗[11]，進而對所有NRTI產生耐藥。但在分析抗病毒治療患者體內病毒載量與耐藥突變位點的關系中發現，M184I/V耐藥突變發生高的患者體內病毒載量較低，這可能與M184I/V突變降低了耐藥毒株的復制能力有關[12]，提示此位點耐藥突變的出現可降低患者體內HIV病毒載量的水平。該研究中未發現高頻出現的耐藥突變位點在含3TC和DDI的一線抗病毒治療方案中差異有統計學意義，這可能與使用這些初始治療方案的患者有約一半患者曾經更換一線治療方案有關，但在低頻率出現的耐藥位點中發現使用含D4T的一線抗病毒治療方案的患者更易出現K65R耐藥突變，這與國外文獻[13]報道一致。

由于河南省是國內最早開始一線抗病毒治療的省份，病毒未抑制患者產生的耐藥突變位點較多，耐藥模式復雜，雖然針對NNRTI和NRTI的耐藥性突變率較高，但針對PI的耐藥突變率還很低(1.31%)，建議應根據耐藥監測情況調整治療方案，減少或避免使用耐藥突變發生率高的NNRTI類藥物的使用，選擇合適的二線抗病毒治療方案，以減少耐藥毒株的產生。

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(2015-11-19收稿責任編輯李沛寰)

Genotype resistant mutations among patients failed to high antiretroviral therapy in Henan Province

YUANYuan1),LIUHongwei1),LIUChunhua1),WANGZhe1),RUANYuhua2),XINGHui2)

1)InstituteforAIDS/STDControlandPrevention,HenanCenterforDiseaseControlandPrevention，Zhengzhou4500162)NationalCenterforAIDS/STDControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing102206

human immunodeficiency virus;drug resistance;antiretroviral treatment;gene mutation;Henan Province

Aim: To analyze the prevalence and diversity of genotype resistant mutations among patients failed to high antiretroviral therapy(HAART) in Henan Province. Methods: A total of 231 serum specimens of AIDS individuals with virus load ≥1 000 copies/mL were collected and had received more than six months treatment with HAART.The HIV-1 pol gene was amplified by RT-PCR，the sequences were then submitted to the Stanford University HIV drug resistance database to analyze the prevalence of resistant mutations. Results: A total of 229 plasma samples were amplified successfully for protease and reverse transcriptase fragments.Out of 229 sequences,185(80.79%),150(65.50%) and 3(1.31%) sequences occurred resistance mutations for non-nucleotide reverse transcriptase inhibitors(NNRTIs),nucleotide reverse transcriptase inhibitors(NRTIs) and protease inhibitors(PIs), respectively.The most common mutations to NNRTIs, NRTIs, and PIs were K103N/S 45.42%(104/229), M184I/V 43.67%(100/229) and M46I 0.87%(2/229), respectively. Univariate logistic regression analysis showed that among AIDS individuals, virus load 5- lg copies/mL decreased the risk of M184I/V mutation(OR=0.283，95%CI=0.136-0.592，P<0.001) compared with virus load 3- lg copies/mL. More than 48 months treatment with HAART had high rate of K103N/S mutation(OR=7.422，95%CI=1.637-33.651，P<0.001), compared with 6- months treatment. HAART with D4T was associated with high K65R mutation rate(P=0.044). Conclusion: The prevalence of HIV-1 drug resistance with complex patterns is higher among patients failed to HAART in Henan. Selecting more suitable antiretroviral treatment regimen is necessary to reduce the emergence of the drug resistant strains.

10.13705/j.issn.1671-6825.2016.05.022

*河南省重點科技攻關計劃項目102102310003，112102310005；河南省衛生科技創新型人才工程專項經費資助項目2010年

，男，1972年2月生，博士，副主任醫師，研究方向：艾滋病防治，E-mail:Hongweiliu36@163.com

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