慢病毒介導PPAR-γ基因對瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖、遷移和侵襲性的影響

李晉福，弓軍勝，梁　鋼，王　鵬，錢會利，陳志婕，張寶林

（1.山西醫科大學第一醫院整形外科　山西 太原　030001；2.山西醫科大學第一醫院病理科　山西 太原　030001）

·基礎研究·

慢病毒介導PPAR-γ基因對瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖、遷移和侵襲性的影響

李晉福1，弓軍勝1，梁鋼2，王鵬1，錢會利1，陳志婕1，張寶林1

（1.山西醫科大學第一醫院整形外科山西 太原030001；2.山西醫科大學第一醫院病理科山西 太原030001）

目的：研究過氧化物酶體增殖物激活受體-γ（PPAR-γ）基因對體外培養的人瘢痕疙瘩成纖維細胞（keloid fibroblasts，KF）增殖、遷移、侵襲性的影響。方法：將攜帶PPAR-γ及綠色熒光蛋白的慢病毒載體（LV-PPAR-γ-GFP，KF-PPAR-γ組）及空載體（LV-GFP，KF-NC組）感染KF細胞，并設空白對照組（KF組），應用實時定量PCR和Western blot分別檢測PPAR-γmRNA及蛋白的表達；MTT法檢測KF細胞增殖情況；劃痕實驗和Trans-well小室實驗檢測KF細胞的體外遷移和侵襲能力。結果：PPAR-γ慢病毒載體感染KF細胞96 h后，KF-PPAR-γ組PPAR-γmRNA和蛋白的表達量明顯高于KF-NC組和KF組，差異有統計學意義（P＜0.05）；MTT結果顯示，KF-PPAR-γ組吸光度A值明顯降低，與KF-NC組和KF組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；劃痕實驗結果顯示劃痕后24 h和48 h，KF-PPAR-γ組劃痕愈合速度明顯慢于KF-NC組（P＜0.05）；Trans-well侵襲結果顯示KF-PPAR-γ組侵襲到下室的細胞數目較KF-NC組明顯減少（P＜0.05）。結論：慢病毒介導PPAR-γ基因能夠抑制KF細胞的增殖、遷移及侵襲能力，提示靶向提高瘢痕疙瘩中PPAR-γ的含量與活性，可能為瘢痕疙瘩的防治提供有效途徑。

過氧化物酶體增殖物激活受體-γ；瘢痕疙瘩；成纖維細胞；增殖；遷移；侵襲

過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferator activated receptor， PPAR）是一類由配體激活的核轉錄因子， 屬于核內受體超家族成員。1990年Issemann等［1］首先發現了這種能被一類脂肪酸樣化合物過氧化物酶體增殖劑（peroxisome proliferators，PP） 激活， 而被命名為PP 激活受體（PPAR）。根據結構的不同，PPAR 可分為α、β（或δ）和γ 3種類型，其中PPAR-γ 基因與脂肪細胞分化、肥胖、胰島素抵抗、糖尿病及腫瘤等多種疾病密切相關［2］，為腫瘤研究提供了新的靶點。瘢痕疙瘩本質為結締組織腫瘤，向周圍正常組織浸潤，具有類腫瘤特性［3］。前期研究表明瘢痕疙瘩的形成可能與PPAR-γ 在組織中的低表達有關。提示采用基因療法提高瘢痕疙瘩中PPAR-γ的含量與活性，可能為瘢痕疙瘩的防治提供有效途徑。因此我們構建了過表達PPAR-γ的慢病毒載體，感染瘢痕疙瘩成纖維細胞，探討過表達PPAR-γ基因對瘢痕疙瘩腫瘤樣生物學特性的影響。

1　材料和方法

1.1材料：重組慢病毒LV-PPAR-γ-GFP和LV-GFP由上海吉凱基因生物技術有限公司合成并鑒定，在293T細胞中進行擴增及滴度測定。DMEM培養基、牛血清白蛋白BSA（10g/L，Gibco公司，美國）；Trans-well小室（聚碳酸酯膜8.0μm，Chemicon公司，美國）、MTT試劑盒。瘢痕疙瘩標本取自山西醫科大學附屬第一醫院整形科門診及住院手術患者（標本術后經病理診斷為瘢痕疙瘩），所有患者均排除了其他器質性疾病，在手術切除前未接受其他任何治療。在征得患者知情同意并簽訂知情同意書后，切除瘢痕組織進行實驗。

1.2方法

1.2.1細胞培養：將切取的瘢痕疙瘩標本剪去表皮和皮下組織，切成1.0～2.0mm3的組織塊，采用組織塊貼壁法進行瘢痕疙瘩成纖維細胞的原代培養，以含20%胎牛血清、青霉素100U/ml、鏈霉素100U/ml的DMEM培養液，于37℃，5% CO2、飽和濕度下培養。

1.2.2慢病毒感染KF細胞：感染復數（multiplicity of infection，MOI）為20感染KF細胞，加入Polybrene至終濃度為5mg/L；96h后，熒光顯微鏡下觀察感染效率，繼續培養。

1.2.3實時熒光定量PCR檢測PPAR-γ基因表達：利用Trizol抽提KF細胞的總RNA，M-MLV反轉錄酶逆轉錄成cDNA，實時定量PCR（Real-time PCR）檢測PPAR-γ mRNA的表達水平。

PPAR-γ基因的上、下游引物為：

5'-ATTCCATTCACAAGAACAGATCCAG-3'

5'-TTTATCTCCACAGACACGACATTCA-3'

管家基因GAPDH為內參，上、下游引物為：

5'-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3'

5'-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3'

1.2.4Western印跡檢測PPAR-γ蛋白表達：抽提KF細胞總蛋白，BCA蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度。SDS-PAGE分離蛋白后電轉移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶TBST溶液封閉過夜后洗膜，分別加入相應的一抗Mouse anti-PPAR-γ（1∶500稀釋）及Mouse anti-GAPDH（1∶5 000稀釋），再分別加入二抗Rabbit anti-mouse IgG-HRP（1∶5 000稀釋），ECL法顯色后化學發光成像儀上顯影，并保存圖像。

1.2.5MTT測定細胞增殖：取對數生長期的KF細胞，將其分為感染LV-PPAR-γ-GFP慢病毒細胞組（KF-PPAR-γ組），陰性對照組即感染LV-GFP慢病毒細胞組（KF-NC組）和空白對照組即未感染慢病毒細胞組（KF組）。以1×104個/孔接種于96孔板培養，每組3個復孔，實驗重復3次，每孔100μl。按MOI為20感染細胞，于不同時間點每孔加入MTT溶液，孵育4 h后離心棄上清，另加入二甲基亞砜（DMSO）振蕩數分鐘，選擇吸光度490 nm波長，在酶標儀上測定各孔的吸光度A值，并記錄結果。

1.2.6劃痕實驗：細胞以5×105個/孔密度接種于6孔板中，待形成細胞單層時，用200μl的槍頭在6孔板內均勻劃直線，更換含1%PBS的培養基繼續培養24h和48h后，在光學顯微鏡下隨機選擇5個視野（×40），測量劃痕寬度，比較各組劃痕愈合的情況。

1.2.7Trans-well侵襲實驗：采用24孔Trans-well（8.0μm濾膜微孔）系統。小室內加入40μl基質膠（Matrigel），1∶3稀釋，用含0.5%BSA的培養基調整細胞密度為5×105個/L，取200μl細胞懸液加入小室內，下室加入1 000μl含10%FBS的培養基，常規培養24h。用棉簽擦去小室上面細胞，固定，HE染色。

1.2.8統計學方法：本實驗結果均經SPSS 15.0統計軟件分析，計量資料用均數±標準差表示，采用t檢驗和方差分析比組間差異，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1重組慢病毒的感染效率：慢病毒以MOI為20感染KF細胞96 h后，熒光倒置顯微鏡下觀察綠色熒光，結果顯示：PPAR-γ慢病毒感染KF細胞達到90%以上感染效率，符合基因治療對載體的要求（圖1）。

圖1　慢病毒介導PPAR-γ基因感染KF細胞：A、B-陽性轉染組200倍（KF-PPAR-γ組）；C、D-陰性轉染組200倍（KF-NC組）

圖2　慢病毒介導PPAR-γ基因感染KF細胞PPAR-γ mRNA相對表達量

圖3　慢病毒介導PPAR-γ基因感染KF細胞后PPAR-γ 蛋白的表達

圖4　慢病毒介導PPAR-γ基因感染KF細胞后各組PPAR-γ蛋白的表達比較

2.2重組慢病毒感染KF細胞后PPAR-γ mRNA和蛋白表達：慢病毒以MOI為20感染KF細胞96 h后，實時熒光定量PCR結果顯示：KF-PPAR-γ組PPAR-γ mRNA表達量明顯高于KF-NC組和KF組，差異有統計學意（P＜0.05，圖2）。Western blot結果表明：KF-PPAR-γ組PPAR-γ蛋白的水平顯著高于KF-NC組和KF組（P＜0.05，圖3、4）。PPAR-γ mRNA和蛋白的表達量，KF-NC組與KF組相比，差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.3MTT實驗檢測細胞增殖：在MOI為20時，瘢痕疙瘩成纖維細胞感染LV-PPAR-γ-GFP后48h出現差異，KF組與KF-NC組比較，吸光度A值差異無統計學意義（P＞0.05）；KFPPAR-γ組吸光度A值明顯降低，與KF-NC組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），提示PPAR-γ可抑制KF細胞增殖（表1、圖5）。

表1　慢病毒介導PPAR-γ基因感染KF細胞后各組的增殖情況

圖5　慢病毒介導PPAR-γ基因感染KF細胞后各組的增殖情況比較

圖6　慢病毒介導PPAR-γ基因感染KF細胞48h后各組的遷移情況

2.4重組慢病毒感染瘢痕疙瘩成纖維細胞后細胞遷移和侵襲能力的改變：劃痕實驗（圖6、7）結果顯示劃痕后24h和48h，KF-PPAR-γ組劃痕愈合速度明顯慢于KF-NC組（P＜0.05）。Trans-well侵襲（圖8、9）結果顯示KF-PPAR-γ組侵襲到下室的細胞數目較KF-NC組明顯減少（P＜0.05）。上述兩組實驗KF-NC組與KF組相比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。

圖7　慢病毒介導PPAR-γ基因感染KF細胞48h后各組的遷移率比較

圖8　慢病毒介導PPAR-γ基因感染KF細胞24h后各組的侵襲情況

圖9　慢病毒介導PPAR-γ基因感染KF細胞48h后各組的侵襲率比較

3　討論

人類的PPAR-γ基因位于染色體3p25，全長大于105kb，含有9個外顯子。由于啟動子和拼接方式不同PPAR-γ mRNA存在1、2、3、4四種異構體。這4種異構體的基因基本相同，均包括外顯子1-6。PPAR-γ1、PPAR-γ3、PPAR-γ4 mRNA生成相同的基因產物PPAR-γ。PPAR-γ2 mRNA生成一個在NH2端有28個氨基酸的蛋白質。4種異構體在不同組織中表達不完全相同。PPAR-γ1在所有組織中均有不同程度表達［4］，PPAR-γ2主要在脂肪組織表達［5］。PPAR-γ3在脂肪組織、巨噬細胞和結腸卜皮細胞以及T淋巴細胞中表達［6-7］。PPAR-γ4的表達尚不清楚［4］。

研究表明，PPAR-γ基因與多種腫瘤的發生、發展密切相關，在抑制腫瘤增殖、侵襲轉移方面具有重要作用［8］。然而，關于PPAR-γ基因與腫瘤關系的研究主要集中在消化系統腫瘤（胃癌、結直腸癌等）、前列腺癌、乳腺癌、肺癌及子宮內膜癌等［9-12］，在瘢痕疙瘩中的研究較少。陜光等［13］采用免疫組織化學SP法檢測50例膀胱尿路上皮癌和50例癌旁組織中PPAR-γ的表達，結果提示：①PPAR-γ在膀胱尿路上皮癌的發病和進展中起著重要的調節作用；②PPAR-γ蛋白表達水平與膀胱尿路上皮癌腫瘤分化程度及病理類型、原發腫瘤直徑、淋巴結轉移、臨床分期均相關，提示PPAR-γ在膀胱尿路上皮癌的增殖、轉移中發揮重要作用。李強等［14］采用免疫組化技術檢測113例胃癌組織中PPAR-γ表達，提示癌組織中PPAR-γ表達與腫瘤的組織學類型、TNM分期密切相關，PPAR-γ可作為胃癌預后的判斷指標。劉江惠等［15］研究發現，在食管癌中PPAR-γ表達與細胞分化程度、淋巴結轉移相關（P均＜0.05）。馬元華等［16］對大腸癌的研究中同樣發現，PPAR-γ表達與腫瘤分化程度、Dukes分期密切相關（P均＜0.05）。楊靖宇［17］通過構建siRNA沉默PPAR-γ的A549細胞系，探討PPAR-γ表達下調對人肺癌A549順鉑耐受性和細胞凋亡的影響，結果提示抑制A549中PPAR-γ的表達后，腫瘤細胞獲得對順鉑藥物更高的耐受性，其機制與升高Akt磷酸化水平和bcl-2表達水平，抑制細胞凋亡有關，PPAR-γ下調是臨床腫瘤產生耐藥性的可能機制之一。PPAR-γ活化后通過上調某些基因促使肝細胞癌（HCC）細胞周期停滯。Okumura［18］認為噻唑烷二酮類可通過激活PPAR-γ，上調基因p27進而促使HCC細胞周期停滯。Koga等［19］的研究表明曲格列酮可使HCC細胞停滯于G0-G1期，且與p21、p27和p18基因的上調密切相關。曲格列酮誘導的p27上調與skp2下調相關，當skp2過表達時，曲格列酮幾乎不能使HCC細胞周期停滯。Cheung等［20］在分子水平發現PPAR-γ攻擊的羧基末端結構-2與p21、p27上調有關。上述結果［18-20］提示，激活的PPAR-γ作用于羧基末端結構-2后，再通過p27或p21/skp2途徑使HCC細胞周期停滯于G0-G1期，為HCC的基因治療提供作用靶點。侯新新等［21］通過調控PPAR-γ基因在子宮內膜癌細胞中的表達，證實上調PPAR-γ基因的表達可抑制子宮內膜癌細胞的遷移、侵襲及增殖，而下調PPAR-γ基因的表達可促進子宮內膜癌細胞的遷移、侵襲及增殖。說明PPAR-γ基因在子宮內膜癌中可能發揮抑癌作用，而PPAR-γ基因的表達缺失可能促進子宮內膜癌的發生、發展。

瘢痕疙瘩為皮膚軟組織損傷后非正常愈合過程中形成的真皮纖維組織腫瘤，呈持續性、漸進性向周邊正常皮膚侵襲性生長，破壞周圍正常皮膚附屬器，無自限傾向，具有類腫瘤特性［3］。我們前期通過實驗發現與正常皮膚成纖維細胞相比，PPAR-γ在瘢痕疙瘩成纖維細胞中呈低表達，提示激活或者過表達PPAR-γ基因可能是抑制瘢痕疙瘩的潛在靶點。為了進一步驗證PPAR-γ對瘢痕疙瘩增殖的作用，以及對瘢痕疙瘩成纖維細胞類腫瘤樣生物學作用的影響，構建了針對PPAR-γ基因的慢病毒表達載體，以探討慢病毒介導的PPAR-γ對瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖、遷移及侵襲能力的影響，結果表明LV-PPAR-γ-GFP感染KF細胞后，PPAR-γ mRNA和蛋白的表達增高，繼而有效地抑制KF細胞的增殖。LV-PPAR-γ-GFP感染KF細胞后通過劃痕實驗和Trans-well實驗發現，過表達PPAR-γ基因能夠抑制KF細胞的遷移和侵襲能力，提示PPAR-γ參與了KF細胞的遷移和侵襲生長過程。Mansure等［22］和Jiang等［23］研究顯示，PPAR-γ基因被激活后，對腫瘤細胞起到抑制增殖、誘導凋亡和抑制侵襲轉移的作用，與本研究結果一致。

綜上所述，PPAR-γ基因可以抑制KF細胞增殖、遷移和侵襲性生長，為進一步靶向治療瘢痕疙瘩提供了新的理論基礎。然而，PPAR-γ在瘢痕疙瘩形成中的機制仍有待進一步研究。

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編輯/張惠娟

Effect of lentivirus-mediated PPAR-γ gene on proliferation，migration and invasion of keloid fbroblasts

LI Jin-fu1，GONG Jun-sheng1，LIANG Gang2，WANG Peng1，QIAN Hui-li1，
CHEN Zhi-jie1， ZHANG Bao-lin1
（1.Department of Plastic Surgery，The First Hospital of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001， Shanxi，China； 2.Department of Pathology， The First Hospital of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001， Shanxi，China）

ObjectiveTo investigate the effect of PPAR-γ gene on proliferation，migration and invasion activity of human keloid fibroblasts（KFs）.MethodsPPAR-γ gene was cloned into lentivirus vector，then the lentivirus particles expressing PPAR-γ were infected into KF cells. Real-time PCR and Western blot were performed to examine the expression of PPAR-γ in lentivirus infected cells. The growth ability was detected by MTT assay.The invasion and migration were detected by matrigel invasion assay and wound healing assay.ResultsComparing to controls group and KF-NC group， the expression levels of PPAR-γ mRNA and protein were both signifcantly up-regulated after 96 hours of PPAR-γ lentivims infection. Comparing with the KF-NC group and KF group，MTT assay showed that the A490 of KF-PPAR-γ group was down-regulated after lentivims infection（P＜0.05）. Transfection of PPAR-γ lentivirus inhibited the migration and invasion activity of KF cells（P＜0.05）. ConclusionLentivirus-mediated PPAR-γ gene effciently inhibits proliferation，migration and invasion activity of KF cells. It suggests that improve the content and activity of PPAR-γ in keloid， which may provide an effective way for the prevention and treatment of the keloid.

peroxisome proliferator activated receptor-γ； keloid； fbroblasts；proliferation； migration；invasion

R619+.6

A

1008-6455（2016）07-0042-05

山西省科技發展計劃＜社會發展＞基金（20110313011-7）；山西省衛生與計劃生育委員會基金，2014032；山西醫科大學第一醫院院基金（YC1415）

張寶林，男，科主任、教授、主任醫師；中華醫學會整形分會全國委員、山西省醫師協會整形美容協會主委；通聯：山西省太原市解放南路85號，郵編：030001

2016-03-23

2016-05-30