miR-21與IL-12在兒童支氣管哮喘血清中的含量及意義

程詩亮　江春燕　倪美良★

miR-21與IL-12在兒童支氣管哮喘血清中的含量及意義

程詩亮江春燕倪美良★

目的 檢測兒童哮喘急性發作期血清miR-21與白介素12（IL-12）的水平及其在哮喘發病中的作用。方法 選取支氣管哮喘兒童60例，并選取同時期60例健康兒童作為對照組，通過逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）和酶聯免疫吸附實驗（ELISA）分別檢測各組血清miR-21與IL-12的含量，并對哮喘患兒血清中miR-21、IL-12和肺功能的關系進行相關性分析。結果 兒童哮喘急性發作期血清中miR-21相對表達量明顯高于對照組（P＜0.01），血清IL-12水平明顯低于對照組（P＜0.01）。血清中miR-21在輕度、中度和重度哮喘患者中的表達水平呈逐漸上升趨勢，各組間差異有統計學意義（P＜0.01）；血清中IL-12在輕度、中度和重度哮喘患者中的表達水平呈逐漸下降趨勢，各組間差異有統計學意義（P＜0.01）。血清中miR-21的相對表達量與FEV1%和PEF%均呈負相關，而血清中IL-12的含量與FEV1%和PEF%均呈正相關。結論 miR-21與IL-12可作為兒童哮喘急性發作期的疾病嚴重性的標志物，可能參與了支氣管哮喘的發病。

兒童 哮喘 microRNA 白介素12

支氣管哮喘是一種氣道慢性炎癥性疾病，是常見的兒童慢性疾?。?］。Th1/Th2細胞亞群的失衡是支氣管哮喘發生、發展的關鍵，Th2優勢分化并大量釋放Th2型細胞因子引起的嗜酸粒細胞性慢性氣道炎癥是哮喘特征性病理改變［2］。作者通過檢測兒童支氣管哮喘急性發作期血清中miR-21與白介素12（IL-12）的含量，探討其在兒童支氣管哮喘發病中的作用和臨床意義。報道如下。

1　臨床資料

1.1一般資料 選取2012年1月至2014年12月間在本院門診或住院治療的支氣管哮喘兒童60例，其中男35例，女25例；平均年齡（9.3±2.52）歲。按照2008年的《兒童支氣管哮喘防治指南》［3］支氣管哮喘急性發作嚴重程度分級，將急性發作期支氣管哮喘兒童分為輕度、中度及重度，其中輕度哮喘24例、中度22例，重度14例。同時選取相同時期在保健科進行正常體檢的健康兒童60例作為健康對照組，男32例，女28例；平均年齡（8.8±1.83）歲。健康對照組兒童均無個人及家庭的哮喘病史和過敏性疾病病史。兩組兒童性別、年齡等差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。標本收集獲得醫院倫理委員會批準，并獲得兒童家長簽署知情同意書。

1.2主要試劑 引物及RNA提取試劑盒均購自InVitrogen公司；miRcute miRNA試劑盒購自Tiangen公司；逆轉錄酶、SYBR Mastermix、RNA酶抑制劑、5Xbuffer、dNTPs等購自于Takara公司。逆轉錄-聚合酶鏈反應（RTPCR）引物序列如下：miRNA-21：（forward）5'-AACCCGUAGAUCUUGGAUCCUG-3'，（reverse） 5-CAAGAUCAUCUACGGUUUGGGU-3'；內參β-Actin：（forward）5'-AGCGGGAAATCGTGCGTGACA-3'，（reverse）5'-GTGGACGGGAGGAGGACTGG-3'。

1.3血清IL-12的檢測 抽取各組空腹血10ml，立即低溫離心（-4°，5000r/min，10min），取血清-80℃凍存，統一采用ELISA試劑盒（美國Santa Cruz公司）進行檢測。

1.4血清microRNA-21的檢測 在無菌無RNA酶條件下用Trizol一步法提取血清總RNA，用生物分光光度儀（日本MaIcom）測定總RNA濃度，0D260/280在1.8～2.0之間。取10ng血清總RNA和3μl逆轉錄酶混合，在15μl的反應體系中逆轉錄cDNA，反應條件：15℃30min，40℃ 30min，80℃5min，逆轉錄產物-80℃保存備用。取cDNA稀釋150倍后，取4μl cDNA與4μl TaqMan引物混合，在20μl反應體系中進行qPCR，定量PCR條件如下：97℃變性10min，70℃退火60s，60℃延伸60s，循環40次。以公式Iog10250-Ct表示microRNA-21的相對表達情況。

1.5肺功能檢測 采用德國雅格功能測試儀（MSPAED），由肺功能室專人負責患兒肺功能檢測。所得主要參數為第1秒用力呼氣肺活量占預計值的百分比（FEV1）和最大呼氣流量占預計值的百分比（PEF），均以實測值占預計值的百分比表示。根據受試者性別、年齡、體重、身高調整測得預計值。

1.6統計學方法 采用SPSS15.0統計軟件。計量資料以（±s）表示。組間比較采用t檢驗，多組數據的差異顯著性分析用單因素方差分析。相關性分析采用Pearman直線相關性分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1哮喘組和對照組血清miR-21與IL-12水平 哮喘急性發作期兒童血清中miR-21相當于內參的表達為（5.16±1.15），而健康對照組中miR-21表達為（3.63±1.54），哮喘組明顯高于對照組（P＜0.01）。哮喘急性發作期兒童血清IL-12水平［（32.13±13.38）ng/L］明顯低于對照組兒童［（62.32±12.18）ng/L］（P＜0.01）。

2.2輕、中及重度哮喘兒童血清miR-21與IL-12水平比較 見表1。

表1　輕、中、重度哮喘患兒血清miR-21與IL-12水平比較（±s）

表1　輕、中、重度哮喘患兒血清miR-21與IL-12水平比較（±s）

注：與輕度組比較，*P＜0.05；與中度組比較，#P＜0.05

組別nmiR-21IL-12（ng/ml）輕度組244.34±1.0258.24±12.21中度組225.62±1.42*36.01±9.48*重度組146.31±2.05* #26.63±15.22*#

2.3血清中miR-21、IL-12水平與肺功能的相關性分析 哮喘兒童血清中miR-21與IL-12含量呈負相關（r=-0.531，P=0.016）。血清中miR-21的相對表達量與FEV1%和PEF%均呈負相關（r=-0.48，P=0.022；r=-0.52，P=0.007）。而血清中IL-12的含量與FEV1%和PEF%均呈正相關（r=0.42，P=0.035；r=0.65，P=0.0001）。

3　討論

近年研究發現［4］，體內白介素12（IL-12）水平的下降與Th1/Th2細胞亞群失衡密切相關。IL-12可有效抑制Th2類細胞因子如IL-4、IL-5等的產生，從而抑制Th2型免疫應答和氣道炎癥反應［5］。但對于哮喘體內IL-12水平下降的上游調控機制的研究較少，尤其是基因調節層面。近年來，microRNA（miRNA）在哮喘發病過程中的作用日益引起重視。MicroRNA是一類長度為21～25個核苷酸單鏈小分子RNA，其主要功能是在轉錄后水平調控與機體生長、發育和疾病發生發展相關基因的表達。近年大量研究發現，miRNA在支氣管哮喘的發病中發揮著至關重要的作用。研究發現［6］，miRNA-155在T細胞向Th1和Th2細胞分化過程中發揮著關鍵作用，通過敲除小鼠miRNA-155后，小鼠氣道重塑增加和免疫耗竭，由此奠定了miRNA在支氣管哮喘發病機制中的地位。

MiR-21與支氣管哮喘發病之間的關系尚存在爭議。本文證實支氣管哮喘兒童血清中miR-21表達量明顯增高，而血清中IL-12的水平明顯降低，而且兩者的血清水平具有明顯相關性。由此可見，miR-21可能通過調控IL-12表達間接參與哮喘的發生。但是也有學者發現［7］，使用脂多糖刺激外周血單核細胞后miR-21表達上調，miR-21通過負性調控NF-κB和PDCD4，抑制炎癥反應，可能對哮喘發病起抑制作用。因此，miR-21在哮喘中的作用及其具體機制仍需進一步研究證實。

本文首次發現，血清中miR-21和IL-12水平與支氣管嚴重性分級和肺功能參數（FEV1%和PEF%）明顯相關，分級越重、肺功能越差的患兒血清中miR-21含量越高，IL-12的含量越低。由此可見，血清中miR-21和IL-12水平可作為評估支氣管哮喘兒童急性發作嚴重程度的血清標志物，通過下調miR-21或上調IL-12的表達可能是治療兒童支氣管哮喘潛在有效途徑。

1 Ren YF， Li H， Xing XH， et al.Preliminary study on pathogenesis of bronchial asthma in children.Pediatr Res，2015，77（4）：506～510.

2 Wang J， Jin RG， Xiao L， et al.Anti-asthma effects of synthetic salidroside through regulation of Th1/Th2 balance.Chin J Nat Med，2014，12（7）：500～504.

3 中華醫學會兒科學分會呼吸學組，中華兒科雜志編輯委員會.兒童支氣管哮喘診斷與防治指南 . 中華兒科雜志，2008，46（10）：745～753.

4 劉勇，吳峰.白介素-12治療支氣管哮喘的研究進展.國際呼吸雜志，2007，27（11）：850～853.

5 張艷麗，王秀芳，雷瑞瑞，等.哮喘、毛細支氣管炎患兒外周血MDSCs、IL-10和IL-12水平及意義.西安交通大學學報（醫學版），2013，34（4）：503～508.

6 Rodriguez A， Vigorito E， Clare S，et al.Requirement of bic/ microRNA-155 for normal immune function. Science，2007， 316（5824）：608～611.

7 Sheedy FJ， Palsson-McDermott E， Hennessy EJ，et al.Negative regulation of TLR4 via targeting of the proinflammatory tumor suppressor PDCD4 by the microRNA miR-21. Nat Immunol，2010，11（2）：141～147.

313100 浙江省長興縣中醫院