云南不同地區非小細胞肺癌EGFR基因突變檢測分析

楊長紹，徐文漭，馮　強，王媛媛，潘鑫艷，王　力，楊舉倫，王　麗

云南不同地區非小細胞肺癌EGFR基因突變檢測分析

楊長紹，徐文漭，馮強，王媛媛，潘鑫艷，王力，楊舉倫，王麗

目的探討云南不同地區非小細胞肺癌(NSCLC)患者的表皮因子生長受體(EGFR)基因突變情況。方法收集2012 年5月～2015年1月本院云南不同地區NSCLC患者手術標本250例，其中昆明86例，宣威81例，其他地區83例。運用ARMS-Taqman探針法檢測標本中EGFR基因突變情況。結果昆明地區86例中，48例 (55.8%)存在EGFR基因突變，其中19Del、L858R占總突變的81.3%（39/48），有4例同時存在19Del、L858R突變；宣威地區81例中，43例(53.1%)存在EGFR基因的突變，其中19Del占總突變的14.0%（6/43），L858R占總突變的34.9%（15/43），G719X及S768I占總突變的41.9%（18/43），有4例同時存在G719X、S768I雙突變；其他地區83例中，40例(48.2%)存在EGFR基因的突變，其中19Del、L858R占總突變的77.5% （31/40）。結論云南大部分地區EGFR基因突變情況與國內報道一致，主要以EGFR基因19Del及L858R突變為主；而宣威地區NSCLC患者中，EGFR基因突變主要以L858R為主，19Del的突變低于云南其他地區，S768I則明顯高于云南其他地區。

非小細胞肺癌；EGFR基因；基因突變；云南

肺癌是目前常見的惡性腫瘤之一，全球每年因肺癌死亡的人數超過100萬，其中NSCLC最常見，約占全部肺癌的80%～90%[1]。在我國，肺癌已成為惡性腫瘤第一死因，而云南省的肺癌發病率與死亡率一直在國內位居榜首。許多研究發現，表皮因子生長受體 （epidermal growth factor receptor,EGFR）基因突變與 EGFR絡氨酸激酶抑制劑（EGFR-tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI）的藥物治療靶點相關，并已被研究及廣泛應用于臨床。但由于地區的差異性，可能導致不同地區NSCLC患者EGFR基因突變存在差異。本研究就云南不同地區NSCLC者的EGFR基因突變情況進行檢測分析。

1　材料與方法

1.1標本來源收集2012年5月～2015年1月本院云南不同地區NSCLC患者手術標本250例，其中宣威地區81例，昆明地區86例，其他地區83例。所有標本均經過10%中性福爾馬林固定、石蠟包埋，NSCLC病理診斷明確，每例標本均含足夠腫瘤病變組織進行后續檢測。

1.2樣本DNA提取用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit試劑盒 （QIAGEN公司）提取標本塊中基因組DNA，按試劑盒說明書進行操作，所提的DNA均保存于-20℃備用。

1.3ARMS-Taqman探針法檢測

1.3.1加樣上機從人EGFR基因突變檢測試劑盒(北京雅康博生物科技有限公司)取出已預分裝的八連管，在冰上融化后短暫離心，按試劑盒說明書進行操作。熒光信號收集時設定為FAM、HEX熒光信號，在60℃設置熒光信號收集。

1.3.2結果判斷根據人EGFR基因突變檢測試劑盒說明書，陽性、陰性對照及FAM、HEX滿足要求則繼續分析樣品的突變情況。

1.4直接測序法從250例標本中隨機選取40例標本，用直接測序法進行驗證。

1.5統計學方法數據采用SPSS22軟件進行統計學處理，組間基因突變風險使用相對危險度（relative risk，RR）比較，RR＜1、P≤0.05，表示該組基因突變風險偏低；RR＞1、P≤0.05，表示該組基因突變風險偏高。

2　結果

2.1云南不同地區NSCLC患者EGFR基因突變分布本組250例標本中，131例 （52.4%）EGFR基因發生突變，不同地區EGFR基因突變率在33.3%～66.7%（表1）。

表1　云南不同地區EGFR基因突變情況［n（％）］????????? ???　n 　????　???? ????　????　??????????　?????????? ???　???　?? ???????　?????????? !"?　???　??????????　?? ??????? #$?　???　??????????　??????? ?? %&?　???　??????????　?????????? ’(?　???　??????????　?????????? )*?　 ??　?? ???????　?? ???? ?? +,?　???　??????????　?????????? -.?　???　??????????　?????????? /??　???　??????????　?????????? 01?　 ??　?? ???????　?????????? 23?　???　??????????　?????????? 45?　???　??????????　??????????

表2　云南不同地區NSCLC患者EGFR基因各外顯子突變比較［n（％）］?????n?????　?????????????????????? ?????　???　????????　???　???　??????　???　??? n 　???　???　???　?　?　?　?　?　? ??????　????? ???　??? !??　???!? "??　" ???　" ???　" ##?　" "#?　" $??　" "?? ?????%&???’?　!?! ???　"?" "??　"?" "??　? ???　" ?!?　" ???　" ???　$ ?"?　" !"? (???)?　??? ???　!?! ???　$?? "??　$ ?"?　" $??　" ?!?　" ?"?　? $$?　" ?#? &???’?　???$" ???????? ???　?#?#$ ???　? !#?　" #??　" ???　" ?"?　?? ???　" "$? *???+?　"?" "??　?"??$ #??　??$ ???　" #$?　" !??　$? !??　" "#?　$ ?"?　" !"? *???+%(???)?　??? $??　!?! ???　$?? "??　" !??　" ???　! !$?　" ???　" ???　" ??? ,??"-?　??? $??　$?$ ???　#?? ???　" #??　" #$?　$ ???　" ?!?　$ "??　" ??? ,??"-%&???’?　$?$ #??　$?$ ???　??$ ???　? ???　" ???　? "??　" ???　" $??　" "??

2.2云南不同地區NSCLC患者EGFR基因突變比較從表2可見，昆明地區86例中，48例(55.8%)存在EGFR基因的突變，其中19Del、L858R占總突變的81.3%（39/48）；其他地區83例中，40例(48.2%)存在EGFR基因的突變，其中19Del、L858R占總突變的77.5%（31/40），各外顯子均無統計學差異。

宣威地區81例中，43例(53.1%)存在EGFR基因的突變，其中19Del占總突變的14.0%（6/43），昆明地區EGFR基因19Del占總突變的35.4%（17/48），兩地區基因突變風險RR＜1，表示宣威地區EGFR基因19Del基因突變風險低于昆明地區（P=0.003）。宣威地區S768I占總突變的23.3%（10/43），昆明地區EGFR基因S768I無獨立突變，宣威地區S768I基因突變風險約是昆明地區的25倍（P=0.003），存在統計學差異。其余各外顯子均無統計學差異。

宣威地區與除昆明外的其他地區比較，EGFR基因19Del基因突變風險RR＜1（P＜0.05），表明宣威地區基因突變風險低于其他地區；而S768I基因突變風險 RR＞1（P＜0.05），表明宣威地區S768I基因突變風險高于其他地區（約12倍）；其余各外顯子均無統計學差異。

2.3直接測序法與ARMS-Taqman探針法檢測結果對比從250例標本中隨機選取40例，用直接測序法進行驗證，其中1例標本ARMS-Taqman探針法檢測EGFR基因突變陰性（圖1），用直接測序法驗證該例EGFR基因20號外顯子第787密碼子（CAG>CAA）同義突變（圖2），但未造成氨基酸改變，結果為陰性。其余標本直接測序法與ARMSTaqman探針法結果一致。

3　討論

EGFR基因位于人第7號染色體p13～q22區域，全長約20萬個堿基，共有28個外顯子，分別編碼胞外區、跨膜區及胞內區3個部分總共1186個氨基酸，其糖基化蛋白的分子量約為170 kDa[2-3]，胞內區具有絡氨酸激酶活性，負責將胞外信號傳遞到胞內。異常的EGFR活化能夠促進腫瘤細胞的增殖、遷移、分化、血管新生，并且能夠抑制腫瘤細胞的凋亡[4]。其中EGFR基因突變主要發生在第18～21號外顯子上[5]。大量研究表明[6-9]，EGFR基因18、19、21號外顯子發生突變的NSCLC患者服用EGFRTKI類藥物的療效較好，因此，在選擇靶向藥物治療之前進行EGFR基因突變檢測尤為重要。

目前，EGFR檢測的方法很多，本研究采用ARMS-Taqman探針法檢測EGFR基因突變狀態，并隨機選取40例標本，用直接測序法進行比對，驗證其結果的準確性，結果表明ARMS-Taqman探針法檢測結果準確、可信。直接測序法是最直接、可檢測已知和未知突變的一種方法，也是目前廣泛應用的EGFR基因突變檢測法[10]。但由于該方法靈敏度相對較低，對于樣本量較少的標本，如穿刺、內窺鏡活檢小標本，可能不能敏感地檢測出突變。而ARMSTaqman探針法檢測靈敏度比直接測序法高，檢測周期短，可以對穿刺標本及細胞學標本進行檢測，且擴增時閉管操作的特點，極大程度避免了擴增產物的污染，易于在臨床樣品中檢測開展。

在中國EGFR基因的突變存在顯著的地域差異，文獻報道[11-14]，臺灣地區的EGFR基因的突變以外顯子21為主，云南和廣東地區以外顯子19為主。本研究結果顯示，云南大部分地區NSCLC患者中，EGFR基因的突變主要發生在19號外顯子缺失及21號外顯子L858R突變，與報道一致。而宣威地區NSCLC患者中，EGFR基因主要以L858R突變為主，19Del的突變低于云南其他地區，S768I則明顯高于云南其他地區，與國內報道存在一定差異。昆明地區NSCLC患者EGFR 18號外顯子G719X占總突變的10.4%（5/48）；宣威地區EGFR 18號外顯子G719X占總突變的18.6%（8/43），其中4例同時存在S768I、G719X雙突變；其他地區EGFR 18號外顯子G719X占總突變10.0%（4/40），其中2例同時存在S768I、G719X雙突變，比文獻報道[15]EGFR 18號外顯子上發生G719X點突變約占EGFR突變類型的4%高。EGFR基因第20號外顯子S768I在昆明及其他地區突變率較低，而宣威地區S768I突變率達到23.3%（10/43），其中S768I、G719X雙突變占9.3%（4/43），遠高出報道的1%及2%[16]。

宣威地區肺癌患者EGFR基因突變與其他地區差異，究竟反映了發病機理的不同，飲食習慣，燃煤因素，還是遺傳學背景的區別，值得深入細致的研究。

圖1　ARMS-Taqman探針法檢測EGFR基因突變

圖2　直接測序法驗證EGFR

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EGFR gene mutation of non-small cell lung cancer from different regions of Yunnan province

Yang Changshao,Xu Wenmang,Feng Qiang,Wang Yuanyuan,Pan Xinyan,Wang Li,Yang Julun,Wang LiDepartment of Pathology,Kunming Generalhospital of Chengdu Military Command,Kunming,Yunnan,650032,China

ObjectiveTo investigate the epidermal growth factor receptor(EGFR)gene mutation of patients with non-small cell lung cancer(NSCLC)from different regions of Yunnan.Methods250 operative specimens of patients with NSCLC who were from different areas of Yunnan andhospitalized between May 2012 and January 2015 were collected,in which there were 86 cases from Kunming city,81 ones from Xuanwei city,and 83 ones from other regions.ARMS-Taqman probe method was used to detect the EGFR gene mutation in those specimens.ResultsAmong the 86 cases from Kunming,there were 48 ones(55.8%)of EGFR gene mutation, in which 19Del or L858R accounted for 81.3%of the total mutation(39/48).19Del and L858R existed at the same time in 4 cases. Among the 81 cases from Xuanwei,there were 43 cases(53.1%)of EGFR gene mutation,in which 19Del,L858R,and G719X or S768I accounted for 14.0%(6/43),34.9%(15/43),and 41.9%(18/43),respectively.Double mutation of G719X and S768I existed in 4 cases.Among the 83 cases from other regions,there were 40 cases(48.2%)of EGFR gene mutation,in which 19Del or L858R accounted for 77.5%(31/40).ConclusionThe situation of EGFR mutation in most regions of Yunnan is the same as that reported in our country,in which 19Del and L858R are the predominant gene.Among the NSCLC patients from Xuanwei,L858R is the main gene mutation.Their proportion of 19Del is lower than that of patients from other regions of Yunnan,but the proportion of S768I is significantlyhigher than that of patients from other regions.

non-small cell lung cancers;EGFR gene;gene mutation detection;Yunnan

R 734.2

A

1004-0188（2016）01-0004-04

10.3969/j.issn.1004-0188.2016.01.002

國家自然科學基金青年基金（81201759）；云南省應用基礎研究面上項目（2012FB210）

650032昆明，成都軍區昆明總醫院病理科

王麗，電話：0871-64774212;E-mail：2001wl@163.com

（2015-11-17）