復方磺胺甲噁唑片《中國藥典》2015版微生物限度檢查法的建立

羅　靜（重慶市食品藥品檢驗檢測研究院重慶市藥物過程與質量控制工程技術研究中心401121）

復方磺胺甲噁唑片《中國藥典》2015版微生物限度檢查法的建立

羅靜（重慶市食品藥品檢驗檢測研究院重慶市藥物過程與質量控制工程技術研究中心401121）

目的建立復方磺胺甲噁唑片的微生物限度檢查法。方法2016年3～5月按照《中國藥典》2015年版（四部）微生物限度計數方法適用性試驗，采用平皿法、薄膜過濾法、薄膜過濾加入中和劑（1.00%對氨基苯甲酸）法對5種陽性菌的回收率進行測定，探索需氧菌、真菌總數的計數方法和控制菌大腸埃希菌檢查方法。結果需氧菌、真菌總數驗證試驗中各菌回收率均達70.00%以上，回收率為0.50%～2.00%時試驗組可檢出大腸埃希菌，該法符合《中國藥典》2015版的要求。結論所建立的方法適用于該品種執行新版藥典要求下的微生物限度檢查，需氧菌總數和控制菌檢查采用薄膜過濾加入中和劑的方法消除復方磺胺甲噁唑片的抑菌作用，真菌總數采用常規法。

復方合劑；磺胺甲基異惡唑/分析；甲氧芐啶/分析；微生物學技術；藥物污染；過濾/方法；中和試驗

復方磺胺甲噁唑片為磺胺類抗菌藥物，是磺胺甲噁唑（SMZ）與甲氧芐啶（TMP）的復方制劑，本品具有較強的抑菌作用，臨床主要用于治療敏感菌，如金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、溶血性鏈球菌、肺炎鏈球菌、瘧原蟲、卡氏肺孢子菌所致的細菌性感染，以及寄生蟲感染、細菌性痢疾、流行性腦脊髓膜炎等［1-3］?！吨袊幍洹?015版的微生物限度檢查法更靠近歐美藥典，與2010年版比較，在試驗菌種、培養基、培養條件和檢驗方法等方面均有較大改變［4-5］。目前，按新版藥典進行微生物計數方法驗證的研究少見［6-7］。2016年3～5月本研究對復方磺胺甲噁唑片進行了微生物限度檢查方法學的驗證，現報道如下。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1樣品本研究所用樣品為重慶科瑞南海制藥有限責任公司產品（規格：SMZ0.4g，TMP80mg，批號：160301）。

1.1.2菌株金黃色葡萄球菌［CMCC（B）26003］、銅綠假單胞菌［CMCC（B）10104］、枯草芽孢桿菌［CMCC（B）63501］、大腸埃希菌［CMCC（B）44102］、白色念珠菌［CMCC （F）98001］、黑曲霉［CMCC（F）98003］均由中國食品藥品檢定研究院提供。

1.1.3培養基及試劑胰酪大豆胨（TSA）瓊脂培養基（批號：141126）、TSA液體培養基（批號：150916）、沙氏葡萄糖（SDA）瓊脂培養基（批號：150824）、麥康凱液體培養基（批號：150924）、麥康凱瓊脂培養基（批號：1511103）、氯化鈉-蛋白胨緩沖液（pH=7.0，批號：150906）、對氨基苯甲酸（批號：070425）等。

1.1.4儀器QUINTIX612-1CN電子天平購自賽多利斯科學儀器（北京）有限公司，HVA-110高壓滅菌器購自日本HIRAYAMA儀器制造公司，SHH-250LD生化培養箱購自重慶四達實驗儀器公司，HF safe-1200生物安全柜購自上海力申科學儀器公司，SW22恒溫振蕩水浴箱購自德國優萊博公司，HTY-100微生物限度檢驗儀購自杭州高利醫療器械公司，S60微生物限度培養器購自浙江泰林生物技術有限公司（批號：20160220）。

1.2方法［8-12］

1.2.1需氧菌、真菌總數計數方法適用性試驗

1.2.1.1菌液的制備取經35℃培養18～24 h的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌液體培養物分別用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋成適宜濃度的菌懸液；取經25℃培養18～24 h的白色念珠菌液體培養物用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋成適宜濃度的菌懸液；取經25℃培養6 d的黑曲霉斜面培養物，加入含0.05%聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫，然后吸出懸液（用管口帶有薄的無菌棉花或紗布能過濾菌絲的無菌毛細吸管）至無菌試管內，用0.9%無菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的孢子懸液。

1.2.1.2需氧菌總數計數（1）試驗組。方法一（薄膜過濾法）：稱取樣品10.0 g，加pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 mL制成1∶10供試液，加入適宜濃度的菌懸液，使每毫升供試液含菌量小于或等于100 cfu，混勻，取1 mL用薄膜過濾，用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液300 mL沖洗，立即倒入TSA瓊脂培養基，待凝固后按規定溫度、時間（需氧菌培養溫度為35℃，培養3 d；真菌培養溫度為25℃，培養5 d）培養，觀察結果。方法二（薄膜過濾法）：除用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液600 mL沖洗外其余步驟與方法一相同。方法三（薄膜過濾加入中和劑法）：稱取樣品10.0 g，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 mL制成1∶10供試液，趁熱加入1.00%無菌對氨基苯甲酸溶液5 mL混勻，加入適宜濃度的菌懸液，使每毫升供試液含菌量小于或等于100 cfu，混勻，取1 mL用薄膜過濾，用含0.01%對氨基苯甲酸的pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液300 mL沖洗，立即倒入含0.01%對氨基苯甲酸的TSA瓊脂培養基，待凝固后按規定的溫度、時間（需氧菌培養溫度為35℃，培養3 d；真菌培養溫度為25℃，培養5 d）培養，觀察結果。方法四（薄膜過濾加入中和劑法）：除用含0.01%對氨基苯甲酸的pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液600 mL沖洗外其余步驟與方法三相同。（2）菌液組。用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100mL替代供試液，加入適宜濃度的菌懸液，使每毫升供試液含菌量小于或等于100 cfu，混勻，取1mL加入平皿中，倒入TSA瓊脂培養基，待凝固后按規定的溫度、時間（需氧菌培養溫度為35℃，培養3 d；真菌培養溫度為25℃，培養5 d）培養，觀察結果。（3）中和劑對照組。用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100mL替代供試液，趁熱加入1.00%對氨基苯甲酸溶液5mL混勻，加入適宜濃度的菌懸液，使每毫升供試液含菌量小于或等于100cfu，混勻，取1mL加入平皿中，倒入含0.01%對氨基苯甲酸的TSA瓊脂培養基，待凝固后按規定的溫度、時間（需氧菌培養溫度為35℃，培養3d；真菌培養溫度為25℃，培養5 d）培養，觀察結果。（4）供試液對照組。按試驗組的供試液制備方法，以稀釋液代替菌液，操作與試驗組相同，按規定的溫度、時間（需氧菌培養溫度為35℃，培養3 d；真菌培養溫度為25℃，培養5 d）培養，觀察結果。另作陰性、空白對照。

1.2.1.3真菌總數計數（1）試驗組。方法一（平皿法）：稱取樣品10.0 g，加pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 mL制成1∶10供試液，加入適宜濃度的菌懸液，使每毫升供試液含菌量小于或等于100 cfu，混勻，取1 mL加入平皿中，立即倒入SDA瓊脂培養基，待凝固后置25℃培養5 d，觀察結果。方法二（平皿法）：稱取樣品2.0 g，加pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 mL制成1∶50供試液，加入適宜濃度的菌懸液，使每毫升供試液含菌量小于或等于100cfu，混勻，取1mL加入平皿中，立即倒入SDA瓊脂培養基，待凝固后置25℃培養5 d，觀察結果。（2）菌液組。取pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100 mL替代供試液，加入適宜濃度的菌懸液，使每毫升供試液含菌量小于或等于100 cfu，混勻，取1 mL加入平皿中，倒入SDA瓊脂培養基，待凝固后置25℃培養5 d，觀察結果。（3）供試液對照組。按試驗組的供試液制備方法，以稀釋液代替菌液，操作與試驗組相同，置25℃培養5 d，觀察結果。另作陰性、空白對照。

1.2.1.4回收率計算方法各菌株回收率（%）=（試驗組菌落數-供試液對照組菌落數）/菌液組菌落數×100%。根據《中國藥典》2015年版（四部）的規定，若回收率為0.50%～2.00%，所用的供試液制備方法及計數方法可用于該樣品的需氧菌、真菌總數的計數。

1.2.2控制菌大腸埃希菌檢查驗證方法

1.2.2.1菌液制備取經35℃培養18～24 h的大腸埃希菌TSA液體培養基培養物用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋至每毫升含菌量小于或等于100 cfu的菌懸液。

1.2.2.2試驗方法（1）試驗組。方法一：取1∶10供試液10 mL與每毫升含菌量小于或等于100 cfu大腸埃希菌同時加入100 mL TSA液體培養基中，按《中國藥典》2015年版（四部）通則1106檢查大腸埃希菌。方法二：取1∶10供試液10 mL薄膜過濾，用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液300ml沖洗，在最后一次沖洗液中加入1.00%對氨基苯甲酸5 mL和每毫升含菌量小于或等于100 cfu大腸埃希菌，置于含0.01%對氨基苯甲酸的100 mL TSA液體培養基中，按《中國藥典》2015年版（四部）通則1106檢查大腸埃希菌。（2）樣品組。取1∶10供試液10mL，以稀釋液代替菌液，操作與試驗組相同，按《中國藥典》2015年版（四部）通則1106檢查大腸埃希菌。（3）陽性對照組。將1mL含菌量小于或等于100cfu大腸埃希菌置于100mL TSA液體培養基中，按《中國藥典》2015年版（四部）通則1106檢查大腸埃希菌。（4）陰性對照組。取稀釋液10 mL加入100 mLTSA液體培養基中，按《中國藥典》2015年版（四部）通則1106檢查大腸埃希菌。

2　結　果

2.1需氧菌總數計數方法適用性試驗3次平行試驗結果陰性、空白對照均無菌生長。3次回收率試驗結果見表1～3。中和劑對照組金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉回收率分別為92.00%、95.00%、94.00%、96.00%、95.00%，均大于50.00%，符合藥典對中和劑的相關要求。

表1　第1次回收率試驗結果（%）

表2　第2次回收率試驗結果（%）

表3　第3次回收率試驗結果（%）

2.2真菌總數計數方法適用性試驗3次平行試驗結果陰性、空白對照均無菌生長。黑曲霉、白色念珠菌的回收率均可達50.00%以上，見表4～6。

表4　第1次回收率試驗結果（%）

表5　第2次回收率試驗結果（%）

表6　第3次回收率試驗結果（%）

2.3控制菌大腸埃希菌檢查3次平行試驗結果樣品對大腸埃希菌有較強抑菌作用，方法二可較好地去除抑菌性，見表7～9。

表7　第1次大腸埃希菌檢查方法適用性試驗結果

表8　第2次大腸埃希菌驗證試驗結果

表9　第3次大腸埃希菌驗證試驗結果

3　討　論

《中國藥典》2015年版整合了2010年版藥典一、二、三部有關微生物內容部分，檢驗方法與國際全面接軌，涵蓋標準和方法的整體變化，涉及品種微生物限度檢查法需要進行重新驗證。涉及附錄1105微生物計數法主要修訂了如下7個方面：（1）目標檢測菌的修訂，①細菌總數改為需氧菌總數（包括細菌、真菌總數）；②真菌總數（細菌數）。（2）培養基檢測系統、稀釋液的修訂。（3）基于培養基性能，對細菌計數定義、靈敏度檢查的修訂。（4）檢驗方法的修訂。（5）刪除方法驗證試驗，增訂計數方法適用性試驗。（6）微生物計數結果判斷的修訂。（7）體例的變化，按試驗順序。修訂后的計數方法將與美國藥典/歐洲藥典/日本藥典協調后的方法一致，結果將更接近供試品微生物污染情況。

復方磺胺甲噁唑片為磺胺類抗菌藥物，具有較強的抑菌活性，因此，本研究在需氧菌總數計數方法適用性試驗方面采用薄膜過濾法，加大沖洗量仍然不能去除薄膜上復方磺胺甲噁唑的抑菌活性，于是查閱文獻［13-14］得知，磺胺類藥物是有抗菌作用的對氨基苯磺酰胺藥物的總稱，其抗菌作用主要是妨礙細菌體內的正常代謝，因為細菌體內的正常代謝必須有對氨基苯甲酸參與，而磺胺類藥物在化學結構上與前者十分類似，很可能被細菌誤認為是對氨基苯甲酸而吸收，以致細菌生長和繁殖受到抑制。為更好地去除復方磺胺甲噁唑片的抑菌性，本研究結合對氨基苯甲酸這種中和劑的競爭性抑制作用，獲得滿意的試驗結果。

試驗中中和劑的加入量應適量，過多會影響培養基的凝固，過少則不能較好地去除供試品的抑菌性，且2015版《中國藥典》要求在制備好的供試液中加入試驗菌液再進行薄膜過濾，因此，本研究在供試液、沖洗液及培養基中均加入了中和劑，本研究采用1∶10供試液100 mL中趁熱加入1.00%對氨基苯甲酸溶液5 mL，另外在沖洗液和TSA瓊脂培養基中均加入0.01%對氨基苯甲酸作為中和劑，可較好地去除抑菌性。

依據本研究結果，可確定其真菌總數采用常規法，需氧菌總數及控制菌大腸埃希菌檢查采用薄膜過濾加入中和劑方法。本研究所建立的驗證方法符合新版藥典的相關規定，可用于該品種微生物限度檢查。

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Establishment of microbial limit test of Chinese Pharmacopoeia（edition 2015）for compound sulfamethoxazole tablets

Luo Jing（Chongqing Municipal Institute for Food and Drug Control/Chongqing Municipal Engineering Research Center for Pharmaceutical Process and Quality Control，Chongqing 40ll2l，China）

ObjectiveTo establish the microbial limit test of compound sulfamethoxazole tablets.MethodsAccording to the applicability test of microbial limit count method provide by the Chinese Pharmacopoeia（edition 2015，part 4），the plate method，membrane filtration method，membrane filtration adding neutralizing agent method were used to detect the recovery rate of 5 kinds of positive bacteria for exploring the count method of aerobic bacteria and fungi，and the detection method of control bacterium Escherichia coli.ResultsIn the verification test of aerobic bacterial and fungal total count，the recovery rate of each bacterium reached more than 70.00%，when the recovery rate was 0.50%-2.00%，Escherichia coli could be detected.This method conformed to the requirements of the 2015 edition of the Chinese Pharmacopoeia.ConclusionThe established method is suitable for the microbial limit test under the new edition of the Chinese Pharmacopoeia.The membrane filtration adding neutralizing agent method for detecting aerobic bacterial and fungal total count is adopted to eliminate the bacteriostasis effect of compound sulfamethoxazole tablets，the fungal total count usually adopts the conventional method.

Drug combinations；Sulfamethoxazole/analysis；Trimethoprim/analysis；Microbiological techniques；Drug contamination；Filtration/methods；Neutralization tests

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.17.011

A

1009-5519（2016）17-2652-04

羅靜（1981-），生藥學碩士研究生，主管中藥師，主要從事中藥材質量標準化研究。

2016-06-01）