岳陽漢族人群HLA-C高分辨等位基因多態性分析

孫　昂，粟玉萍，代　敏，蘇湘暉，胡　濱，陳　敏（岳陽市中心血站，湖南414000）

岳陽漢族人群HLA-C高分辨等位基因多態性分析

孫昂，粟玉萍，代敏，蘇湘暉，胡濱，陳敏（岳陽市中心血站，湖南414000）

目的了解岳陽漢族人群人類白細胞抗原-C（HLA-C）高分辨等位基因多態性及分布特征。方法2014年10月至2015年8月采用基于Illumina Miseq二代測序技術對岳陽地區2 504例造血干細胞捐獻志愿者HLA-C進行高分辨基因分型，直接計算等位基因頻率，對其分布規律進行統計學分析。結果2 504例造血干細胞捐獻志愿者中檢出67個HLA-C等位基因，其中頻率大于0.050 0的常見等位基因分別為C*03：03：01、C*03：02：02：01、C*08：01：01、C*03：04：01：02、C*07：02：01：01、C*01：02：01。HLA-C位點基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡，觀察值（0.880 2）與期望值（0.876 6）比較，差異無統計學意義（P=0.214 5）。結論獲得了岳陽地區漢族人群HLA-C等位基因的分布規律和特征，為人類學、移植配型、疾病相關性等研究提供了參考數據。

HLA-C抗原/遺傳學；等位基因；基因頻率；多態性，單核苷酸；高分辨基因分型

人類白細胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）基因系統根據編碼分子的分布與功能不同分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ3大類，HLA-C屬Ⅰ類基因。HLA-A、HLA-B、DRB1基因是早期研究的與造血干細胞移植密切相關的3個功能基因，隨著非血緣造血干細胞移植的增加，HLA-C基因在造血干細胞移植中的重要性日益受到重視［1］。目前，國外造血干細胞移植均對供患者進行HLA-C高分辨基因配型。本研究采用高分辨分型技術對岳陽地區2 504例漢族造血干細胞捐獻者的血液標本進行HLA-C基因分型，旨在從高分辨水平了解HLA-C基因多態性及分布特征。

1　資料與方法

1.1資料

1.1.1標本來源本研究2 504例血樣全部來自中華骨髓庫湖南分庫岳陽招募站2014年10月至2015年8月招募的造血干細胞捐獻志愿者，全部為漢族，岳陽本地人，年齡18～45歲，身體狀況符合捐獻者健康征詢要求，留取乙二胺四乙酸抗凝靜脈全血5～8 mL。

1.1.2主要設備與試劑KAIAO K5500超微量分光光度計（北京凱奧科技發展有限公司），TAILONG NP968全自動核酸提取純化系統（西安天隆科技有限公司），Miseq高通道測序平臺（美國Illumina），GeneAmp PCR System 9700型擴增儀（美國ABI），7500 Real Time PCR儀（美國ABI），DNA提取試劑（西安天隆科技有限公司，批號：E0814120131），HLA-A、HLA-B、HLA-C、DRB1、DQB1基因二代測序試劑（荷蘭GenDx公司，批號：C-15000192）等。

1.2方法使用DNA提取試劑，在全自動核酸提取純化系統上提取 DNA，DNA質量濃度大于 50 ng/μL，OD260/OD280比值為1.7～1.9。按照二代測序試劑盒說明書進行HLA-C等位基因高分辨檢測，對無法確定的基因分型結果采用Zhou等［2］的方法進行精確分型。

1.3統計學處理采用直接計數法計算等位基因頻率，應用Arlerquin3.5軟件進行Hardy-Weinberg平衡檢驗，P＞0.05為觀察值與期望值比較差異無統計學意義。

2　結　果

2.1岳陽漢族人群HLA-C基因頻率和分布特征2 504份標本中檢出HLA-C等位基因67個，頻率大于0.050 0的常見等位基因分別為C*03：03：01、C*03：02：02：01、C*08：01：01、C*03：04：01：02、C*07：02：01：01、C*01：02：01，累計頻率為0.723 4。2個以上亞型的HLA-C等位基因11個，分別為C*01、C*03、C*04、C*05、C*06、C*07、C*08、C*12、C*14、C*15、C*16位點，見表1。

表1　岳陽漢族人群HLA-C高分辨等位基因頻率分布

續表1　岳陽漢族人群HLA-C高分辨等位基因頻率分布

2.2Hardy-Weinberg平衡檢驗HLA-C基因位點觀察值為0.880 2，期望值為0.876 6，觀察值與期望值比較，差異無統計學意義（P=0.2145），符合Hardy-Weinberg平衡。

3　討　論

HLA是人類最復雜的遺傳多態性系統，是由一系列緊密連鎖的基因組成的具有高度多態性的復合體。1956年開始進行HLA分型工作，隨著科技的發展和研究的深入，HLA分型技術從最初的血清學技術發展到高分辨DNA測序技術，越來越多的HLA等位基因被發現，截至2016年3月底已確定HLA-Ⅰ類基因10 574個，其中HLA-C位點2 902個（數據來源于www.ebi.ac.uk/ipd/ imgt/hla/stats.html）。本研究采用基于Illumina Miseq二代測序技術（即邊合成邊測序，在生產新DNA鏈時加入被熒光標記的脫氧核糖核苷三磷酸，在合成互補鏈時釋放出熒光信號，通過捕獲熒光信號，轉化為一個測序峰值，獲得互補鏈序列信息，經過多個循環后完整讀取核酸序列［3］）對岳陽地區2 504例漢族造血干細胞捐獻志愿者進行HLA-C基因分型，共檢出67個HLA-C等位基因，11個HLA-C等位基因有2個以上亞型，分別為C*01、C*03、C*04、C*05、C*06、C*07、C*08、C*12、C*14、C*15、C*16位點，表明HLA-C基因具有較高的多態性；頻率大于 0.050 0的常見等位基因分別為 C*03：03：01、C*03：02：02：01、C*08：01：01、C*03：04：01：02、C*07：02：01：01、C*01：02：01，分別為267例（0.053 3）、304例（0.060 7）、442例（0.088 2）、611例（0.122 0）、934例（0.186 5）、1 065例（0.212 6），占全部HLA-C等位基因的0.723 4。HLA-C基因位點觀察值（0.880 2）與期望值（0.876 6）比較，差異無統計學意義（P=0.214 5），符合Hardy-Weinberg平衡。

HLA基因多態性及分布特征與人種、民族及地域有關，我國地域廣大，南北地區漢族人群HLA基因分布存在差異［4］，HLA-C基因也存在差異，C*01：02、C*07：02、C*03：04、C*08：01、C*03：02為中國漢族人群常見等位基因。岳陽漢族人群HLA-C的分布特征與李楨等［5］研究的深圳漢族人群和夏玲等［6］研究的四川漢族人群比較，C*04：01：01：01分布存在差異（深圳漢族人群出現頻率為0.0686，四川漢族人群出現頻率為0.069 7，岳陽漢族人群出現頻率為0.043 3），與梁曉嵐等［7］研究的北方漢族人群比較，C*14：02：01分布存在差異（北方漢族人群出現頻率為0.052 6，岳陽漢族人群出現頻率為0.0443），可能與研究樣本量大小、基因分型方法不同有關，也可能是岳陽漢族人群HLA-C基因分布具有其自身特點。

HLA-C位點位于人類第6號染色體短臂的HLA-A、HLA-B位點之間，全長4.5 kb，其編碼產物屬HLA-Ⅰ類分子，HLA-C位點曾被認為不具有多態性而未被重視，隨著HLA分型技術的發展，人們逐漸發現，HLA-C與HLA-A、HLA-B基因一樣，具有高度多態性［8］，其分布于有核細胞表明其參與了免疫反應，HLA-C可與殺傷細胞免疫球蛋白樣受體（killer cell immunoglobulin-like receptor，KIR）組成KIR/HLA-C信號傳導通路，在免疫調節中發揮重要作用［9］。近年來，有關HLA-C基因與疾病相關性的研究不斷深入，有研究發現，HLA-C-35 kb C/T與人類免疫缺陷病毒-1感染具有相關性［10］，HLAC1C1為山東漢族人群梅毒的抗性基因型［11］，HLA-C1基因組表達水平降低可引起早期復發性流產［12］，HLA-C基因相合的造血干細胞移植急性移植物抗宿主病的發生明顯降低、存活時間明顯延長［13］。隨著研究的深入，HLA-C基因在個體抗感染免疫、腫瘤免疫、移植免疫及與疾病發生的相關性將逐漸被發現，對預防和早期診斷、治療疾病具有重要意義。

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10.3969/j.issn.1009-5519.2016.17.043

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1009-5519（2016）17-2726-03

2016-05-13）