水稻粒形基因GW8的功能標記開發和單體型鑒定

裔傳燈王德榮 蔣 偉 李 瑋 成曉俊 王 穎 周 勇 梁國華 顧銘洪

揚州大學江蘇省作物遺傳生理國家重點實驗室培育點 / 糧食作物現代產業技術協同創新中心 / 教育部植物功能基因組學重點實驗室， 江蘇揚州 225009

水稻粒形基因GW8的功能標記開發和單體型鑒定

裔傳燈*王德榮 蔣 偉 李 瑋 成曉俊 王 穎 周 勇 梁國華 顧銘洪

揚州大學江蘇省作物遺傳生理國家重點實驗室培育點 / 糧食作物現代產業技術協同創新中心 / 教育部植物功能基因組學重點實驗室， 江蘇揚州 225009

水稻粒形性狀包含粒長、粒寬、粒厚和長寬比， 是一類影響水稻產量和品質的重要性狀。基于基因GW8序列分析， 在該基因啟動子區10 bp的Indel和第3外顯子A/C和T/G的2個變異位點分別開發了功能標記， 并將其用于294份水稻微核心種質和2007—2013年江蘇省審定的65份粳稻品種的基因型鑒定。研究結果表明這3個變異位點的等位變異對主要的粒形性狀有著顯著或極顯著的影響； 其在水稻微核心種質存在的 8種單體型對水稻粒形性狀有著極顯著的影響， 其中分別有126、85和58個代表品種的Hap3、Hap6和Hap1是最主要的單體型， 單體型Hap7對應水稻籽粒的粒長最長、長寬比最大、千粒重最大； 而江蘇省審定的粳稻品種中僅發現分別有63個和2個代表品種的單體型是Hap6和Hap2。這些研究結果為水稻產量和品質育種中充分利用基因GW8的優異等位基因或單體型奠定了基礎。

水稻； 粒形； 基因GW8； 功能標記； 單體型

水稻產量是由單位面積株數、每株穗數、每穗實粒數和千粒重 4個因素共同決定的， 其中千粒重主要受水稻籽粒的粒形影響。水稻的粒形性狀包括粒長、粒寬、粒厚和長寬比［1］。目前多個水稻粒形相關基因， 如GW2［2］、GS3［3］、qGL3/GL3.1［4-5］、qSW5/ GW5［6-7］、GS5［8］、GS6［9］、GW7［10］、GW8［11］、SLG7［12］、TGW6［13］等克隆研究證實， 通過調節粒形性狀可以增加千粒重， 從而提高水稻產量水平。同時GW8［11］和GW7［10］對稻米品質， 尤其是稻米的外觀品質也有著重要的影響［14］。因此粒形性狀調控機制的研究對水稻的產量育種和品質育種有著重要的參考價值。

GW8是水稻重要粒形基因之一。Wang等［11］研究發現基因GW8編碼細胞增殖的正調控因子， 來自水稻品種華粳秈74的基因GW8啟動子區10 bp序列（GAGCTGAGCT）的存在， 對于該基因在幼穗中的正常表達有著重要的作用， 從而增加了籽粒的粒寬， 進而提高了水稻產量； 而來自水稻品種Basmati 385的基因gw8啟動子區10 bp序列的缺失，導致該基因表達降低， 籽粒的寬度變小， 從而提高了稻米的外觀品質。目前該基因其他的變異位點對水稻粒形性狀有何效應還不清楚。

為了加快基因 GW8有利等位變異在水稻育種中的應用， 本研究對已知的功能變異和未知功能的錯義突變開發了相應的功能標記， 結合水稻微核心種質和近年來江蘇審定的粳稻的基因型檢測， 分析了這些變異位點和組合（單體型）對水稻粒形性狀的影響， 以期為我國和江蘇省的水稻產量和品質育種提供理論依據和快捷的選擇手段。

1　材料與方法

1.1供試材料

選用294份水稻微核心種質和65份江蘇省在2007—2013年期間審定的粳稻品種［15］。水稻微核心種質具有豐富的遺傳多樣性， 其包括從1530份國外栽培稻品種中篩選出的96份微核心種質， 從4310份中國栽培稻品種中篩選出的198份微核心種質［16］。這些種質材料覆蓋全球五大洲74個國家或研究機構［17］，來自國內外不同稻作區， 它們的感光性存在較大的差異。為確保能夠正常抽穗， 2013年11月于海南陵水播種所有供試水稻品種并育苗， 2014年1月移栽大田，田間管理同常規水稻品種。待水稻籽粒完全成熟后收種， 曬干后測量水稻籽粒相關性狀。

1.2水稻成熟種子粒形相關性狀數據的測定

參照《水稻種質資源描述規范和數據標準》的方法［18］收獲并風干水稻種子， 挑選飽滿成熟種子使用游標卡尺（精確到0.01 mm）測量粒長、粒寬和粒厚，5次重復， 計算平均值。用電子天平測定1000粒成熟烘干種子的重量， 3次重復， 計算平均值。

1.3基因 GW8序列變異的分析和功能標記的設計

從Rice Genome Annotation Project網站（http：// rice.plantbiology.msu.edu/）下載到 GW8基因的基因組 DNA序列（LOC_Os08g41940）。以 LOC_Os08g 41940序列作為種子序列， 在NCBI網站核酸序列數據庫中找到高度同源的 3個基因組 DNA序列（JX867117、JX867118和JX867119）和1個cDNA序列（AK109469）。借助BioEdit軟件對上述序列比對分析。

利用Primer Premier 5.0軟件對基因GW8啟動子區一個10 bp的Indel序列變異和第3外顯子的2個錯義突變的點突變分別設計測序引物、dCAPs和CAPs標記。由生工生物工程（上海）股份有限公司合成引物和測序。

1.4DNA提取

收集供試材料分蘗盛期新鮮幼嫩的葉片， 采用SDS法提取水稻基因組DNA。

1.5PCR擴增、酶切和電泳

PCR體系含50 ng μL-1基因組DNA 2.0 μL、2 μmol L-1引物F和R各2.5 μL、10×緩沖液2.0 μL、25 mmol L-1MgCl22.0 μL、2.5 mmol L-1dNTP 1.6 μL、5 U μL-1Taq DNA聚合酶（TaKaRa code： R001C）0.2 μL或1.25 U μL-1高保真DNA聚合酶（PrimeSTAR GXL DNA Polymerase， TaKaRa Code：DR050S） 1.0 μL， 以滅菌雙蒸水補足至 20 μL。在Eppendorf Master cycler proS PCR儀上進行擴增， 反應條件為： （1） 94℃， 預變性5 min； （2） 94℃， 30 s； 55～60℃， 30 s； 72℃， 1 min；共35個循環； （3） 72℃再延伸10 min。反應產物經3.0%的瓊脂糖凝膠電泳分離， 篩選出最清晰、單一且沒有雜帶的引物。

利用篩選的PCR引物擴增基因GW8的目標片段， 進一步用于酶切反應。酶切反應體系為 10 μL，含PCR反應產物5 μL、10×buffer 1 μL、酶（10 U μL-1）0.25 μL、ddH2O 3.75 μL。混勻后置37℃恒溫水浴鍋酶切 3～4 h， 酶切產物經 3.0%瓊脂糖凝膠電泳， EB染色， 紫外凝膠成相系統成像。

1.6數據分析

用Microsoft Excel和SPSS軟件分析和處理數據。

2　結果與分析

2.1基因序列分析和分子標記設計

序列比對分析表明， 基因GW8的基因組DNA序列有52處變異， 其中46個變異發生在非編碼區。除了Wang等［11］已報道位于啟動子區（轉錄起始點上游23 bp處）的10 bp Indel變異與該基因功能密切相關外， 該基因的3個外顯子中， 共有6個序列變異位點。以基因GW8的編碼序列LOC_Os08g41940作為參照， 第1外顯子第36 bp、236 bp和329 bp處分別有C/T同義突變、C/T錯義突變和CGG的Indel變異， 其中后 2個變異與啟動子變異類型高度相關。第3外顯子的第821 bp、1092 bp、1119 bp處分別有C/A錯義突變、G/T錯義突變和G/A同義突變。因此對基因GW8的啟動子區的10 bp Indel變異和第3外顯子的 2個錯義突變位點分別開發了測序引物（GW8-1）、dCAPs （GW8-2）和 CAPs （GW8-3）標記（表1）。

表1　基于基因GW8啟動子區和第3外顯子DNA序列變異設計的PCR引物Table 1 PCR primers based on the GW8 DNA sequence variations in promotor and exon3

利用分子標記GW8-1對包含基因GW8啟動子區變異區域的151 bp的DNA序列進行高保真擴增，將獲得的 PCR產物（圖 1-A）測序， 完成待測水稻品種基因GW8啟動子變異類型的判定。

對于基因GW8第3外顯子的第821 bp處的C/A單堿基變異， 利用標記GW8-2在水稻品種中擴增出長度為108 bp的PCR產物， 經過限制性內切酶Hind II酶切后， 能夠被切成89 bp條帶的水稻材料基因型為A （如圖1-B的泳道3和4）； PCR產物仍為108 bp的水稻材料基因型為C （如圖1-B的泳道1和2）。

圖1　基因GW8不同變異位點特異引物的PCR鑒定Fig. 1 PCR identification of specific primers for corresponding mutation sites in gene GW8A： 是引物GW8-1的擴增產物電泳圖； B和C： 分別是引物GW8-2和GW8-3的擴增產物酶切電泳圖。M： DL2000 DNA marker （TaKaRa），泳道1～4： 分別為水稻品種Basmati、日本晴、9311和華粳秈74。A： PCR amplification products of primer GW8-1； B and C： enzyme-digested PCR amplification products of primer GW8-2（B） and GW8-3（C）. M： DL2000 DNA marker （TaKaRa）； lanes 1-4： Basmati， Nipponbare， 9311， and Huajingxian 74， respectively.

對于基因GW8第3外顯子的第1092 bp處的G/T單堿基變異， 利用標記GW8-3在水稻品種中擴增出長度為164 bp的PCR產物， 經過限制性內切酶Nco I酶切后， 能夠被切成134 bp條帶的水稻材料基因型為G （如圖1-C的泳道1和2）； PCR產物仍為164 bp的水稻材料基因型為T （如圖1-C的泳道3和4）。

2.2基因GW8不同變異位點對水稻粒形的影響

從表2可以看出， 基因GW8的啟動子10 bp的Indel變異位點和第 3外顯子的 G/T變異位點對粒長、粒寬、粒厚和籽粒長寬比都有極顯著的影響； 第3外顯子的 C/A變異位點對粒長和粒寬有極顯著的影響， 對粒厚有顯著影響； 但是這3個變異位點對千粒重都沒有顯著影響， 這表明基因 GW8的3個等位變異對水稻籽粒的粒形性狀有著重要的影響。

2.3基因GW8的單體型分析

為了進一步明確基因GW8這3個變異位點的不同組合（單體型）對水稻籽粒相關性狀的效應， 依據這 3個變異位點在水稻微核心種質中的不同組合將基因GW8分成了8個單體型（表4）。因為單體型8 （Hap8）只有一個樣本， 無法參與方差分析， 所以利用基因GW8的其余7個單體型對水稻粒形性狀進行了方差分析（表3）和多重比較（表4）。

表3　基因GW8不同單體型粒形性狀的方差分析Table 3 Analysis of variances （ANOVA） of different haplotypes in gene GW8

從表3可看出， 除千粒重外， 基因GW8的不同單體型對水稻籽粒的粒長、粒寬、粒厚和籽粒長寬比這 4個粒形性狀都有著極顯著的影響。多重比較進一步表明基因GW8的不同單體型對這4個粒形性狀也有著不同程度的影響（表4）， 其中具有Hap7的水稻籽粒的粒長最長、長寬比最大、千粒重最大， 具有Hap5的水稻籽粒的粒寬最大、粒厚最大、長寬比最小。

從基因 GW8的各單體型分布頻率來看， 以Hap3對應的水稻品種最多， 占水稻微核心種質的42.86%； 其次為 Hap6和 Hap1， 分別占水稻微核心種質的28.91%和19.73%。這表明基因GW8的單體型在水稻種質中分布不是均勻的， 這可能與水稻育種家對水稻籽粒的粒形性狀選擇有關。

2.4近年來江蘇育成品種的基因 GW8單體型分析

為了更好地指導育種家在水稻育種中對籽粒相關性狀的選擇， 對 2007—2013年江蘇省審定的 65份粳稻品種進行了基因GW8的3個目標變異位點的基因型測定。從表 5可以看出， 近年來江蘇省審定的粳稻品種中， 2個水稻品種利用基因GW8的Hap2單體型； 而其余63個水稻品種都為單體型Hap6， 具有該單體型的水稻粒形表現為粒長較短、粒寬較寬、粒厚較厚、長寬比較小的特點。這表明江蘇省近年來育成水稻品種的粒形基因GW8遺傳基礎比較狹窄。

表4　基因GW8不同單體型對水稻粒形性狀的差異顯著性分析Table 4 Analysis of the difference of grain-related traits based on different haplotypes in gene GW8

表5　近年來江蘇省審定水稻品種基因GW8不同單體型的粒形性狀Table 5 Grain-related traits of gene GW8 different haplotypes in recently certified new rice varieties

3　討論

籽粒是水稻一生中最大的庫， 是水稻光合產物重要的貯存器官。調節水稻籽粒的大小和形狀（即粒形）， 增加光合產物的積累， 與提高產量（尤其是產量的構成因子千粒重）有著直接的關系。Wang等［11］研究發現， 在水稻品種Basmati基因gw8的背景下， 無論基因GS3存在與否， 來源于水稻品種華粳秈74的基因GW8都可以通過增加粒寬提高千粒重。但是本研究發現這 3個變異位點對水稻的粒長、粒寬和粒厚有著極顯著或顯著的影響， 而對千粒重的影響沒有達到顯著水平， 這可能是由于水稻的千粒重涉及多個基因位點， 或者基因GW8對千粒重的影響較小。

隨著水稻分子生物學的進展， 雖然許多與水稻產量相關的重要功能粒形基因已被克隆［3-13］， 但是這些基因還很少在水稻育種工作中得以利用， 主要受制于這些基因缺乏開發成本低廉且簡便實用的基因功能標記， 且不明確這些基因有多少等位變異類型及各等位變異類型的效應如何等等。利用近等基因系和轉基因的方法， Wang等［11］證實了基因GW8的啟動子10 bp Indel變異對水稻粒形有重要的影響，其研究中涉及的基因型主要為水稻品種華粳秈74的單體型Hap3和Basmati的單體型Hap6。此外， 我們還借助基因GW8第3外顯子的2個錯義突變的功能標記，檢測到水稻微核心種質的其他6個不同的單體型， 這些不同的單體型對粒形有著不同程度的影響。一般認為細長粒堊白粒率較低， 其稻米外觀品質較好［19-20］。本研究在基因GW8的所有單體型中， 單體型Hap7對應水稻籽粒的粒長最長、長寬比最大， 有利于改善稻米的外觀品質； 同時其千粒重最高， 也有著提高水稻產量的潛力。這種單體型具有較高的水稻育種應用價值， 但是在當前育成的水稻品種中還沒有得到利用。單體型Hap5對應的水稻籽粒具有寬、厚和長寬比小的特點， 有助于提高整精米率， 進而改善稻米的碾磨品質。江蘇省近年來審定的粳稻品種主要利用基因GW8的單體型Hap6， 其籽粒短、寬、厚、長寬比小， 千粒重較小， 不利于提高水稻產量和改善稻米外觀品質， 因此還需要進一步加強對粒形有利基因資源的開發和利用。

4　結論

基于水稻基因GW8的啟動子區的10 bp的Indel變異和第3外顯子A/C和T/G兩處錯義突變， 分別開發了特異性的功能標記， 結合水稻微核心種質，分析了這3個變異位點及其組合而成的8種單體型對水稻粒形的影響， 同時發現江蘇省近年來審定的粳稻品種主要利用了其中的一種單體型。

致謝： 感謝華南農業大學張桂權教授提供的水稻品種Basmati 385種子， 中國農業大學李自超教授和張洪亮博士提供的水稻微核心種質， 江蘇省農業科學研究院王軍博士提供的2007—2013年江蘇省審定的粳稻品種。

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Development of Functional Markers and Identification of Haplotypes for Rice Grain Shape Gene GW8

YI Chuan-Deng*， WANG De-Rong， JIANG Wei， Li Wei， CHENG Xiao-Jun， WANG Ying， ZHOU Yong， LIANG Guo-Hua， and GU Ming-Hong
Jiangsu Key Laboratory of Crop Genetics and Physiology， Co-Innovation Center for Modern Production Technology of Grain Crops， Key Laboratory of Plant Functional Genomics of the Ministry of Education， Yangzhou University， Yangzhou 225009， China

Rice grain shape including grain length， grain width， grain thickness， and grain length-to-width ratio is a major character affecting rice yield and quality. On the basis of the alignment of gene GW8 genomic DNA sequence， three functional markers were developed on the 10-bp indel in promoter region and two missense polymorphism sites （A/C and T/G） in the exon3， respectively. Subsequently the markers were used to identify the genotypes of gene GW8 in the 294 accessions of rice mini-core collection and 65 japonica varieties certificated in Jiangsu province from 2007 to 2013. We found that the allelic variations of the three target loci had significant or very significant effects on most traits of grain shape. On the bais of the three variation sites of gene GW8， eight haplotypes （combinations） were found to have very significant effect on the four grain shape traits in the rice mini-core collection. The main haplotypes were Hap3， Hap6， and Hap1， contained in 126， 85， and 58 representative varieties，respectively； Hap7 has the most strongest effect on grain length， ratio of length to width and 1000-grain weight. While the only two haplotypes， Hap6 and Hap2， contained in 63 and 2 japonica varieties certificated in Jiangsu provice， respectively. The results paved a way to apply the useful allelic variations or haplotypes of gene GW8 in rice yield and quality breeding programs.

Rice； Grain shape； Gene GW8； Functional markers； Haplotype

10.3724/SP.J.1006.2016.01291

本研究由國家自然科學基金項目（31571624， 31071382）， 國家重點基礎研究發展計劃（973計劃）項目（2010CB125904， 2013CBA01405），江蘇省高校自然科學研究重大項目（15KJA210004）和江蘇高校優勢學科建設工程項目資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China （31571624， 31071382）， National Basic Research Program of China （973 program） （2010CB125904， 2013CBA01405）， the Key Natural Science Project in University of Jiangsu Province （15KJA210004），and the Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions.

（Corresponding author）： 裔傳燈， E-mail： cdyi@yzu.edu.cn

Received（）： 2016-01-04； Accepted（接受日期）： 2016-05-09； Published online（網絡出版日期）： 2016-05-30.

URL： http：//www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20160530.0905.004.html