甘蔗捕光葉綠素a/b結合蛋白基因ScLhca3的克隆及表達

翟玉山 鄧宇晴 董 萌 徐 倩 程光遠 彭 磊 林彥銓徐景升

福建農林大學 / 農業部福建甘蔗生物學與遺傳改良重點實驗室， 福建福州 350002

甘蔗捕光葉綠素a/b結合蛋白基因ScLhca3的克隆及表達

翟玉山 鄧宇晴 董 萌 徐 倩 程光遠 彭 磊 林彥銓*徐景升*

福建農林大學 / 農業部福建甘蔗生物學與遺傳改良重點實驗室， 福建福州 350002

捕光葉綠素a/b結合蛋白是植物光系統I （photosystem I， PSI）中與色素分子結合的膜蛋白， 由Lhca基因家族編碼， 主要參與光合作用中光能的捕獲與傳遞。本研究對甘蔗葉片cDNA文庫測序， 獲得甘蔗PSI中Lhca3基因的cDNA序列， 命名為ScLhca3 （GenBank登錄號為KU215669）。生物信息學分析表明， ScLhca3的開放讀碼框（opening reading frame， ORF）長度為804 bp， 編碼267個氨基酸， 分子量為28.91 kD， 等電點為8.96； ScLhca3被定位于葉綠體，無信號肽， 存在3個明顯的跨膜區域， 含有典型的捕光葉綠素a/b結合蛋白功能域（chlorophyll a/b binding domain）， 為親水性非分泌蛋白。多序列比對和進化分析表明， ScLhca3在不同物種間具有較強的保守性， 具有種屬特性。構建原核表達載體pGEX-6P-1-ScLhca3， 通過IPTG誘導表明， ScLhca3蛋白與預測大小一致。亞細胞定位試驗顯示， ScLhca3與報告基因GFP的融合蛋白定位于葉綠體中。實時定量PCR分析表明， ScLhca3在成熟葉片中的相對表達量最高， 根中幾乎不表達， 具有明顯的組織特異性； 在 CdCl2、ABA和 H2O2外源脅迫下， ScLhca3均上調表達； 在黑暗、NaCl 和PEG脅迫下則下調表達。

甘蔗； 光系統I； 捕光葉綠素a/b結合蛋白； 實時定量PCR

捕光葉綠素a/b結合蛋白（light harvesting chlorophyll a/b binding protein， LHC）是光合系統中的重要功能蛋白， 定位于葉綠體類囊體膜上， 與色素結合形成捕光色素蛋白復合體［1］。該復合體能捕獲光能， 并迅速把光能傳到PSI （photosystem I， PSI）和光系統II （photosystem II， PSII）的反應中心， 引起光化學反應， 將光能轉化為化學能。在高等植物和綠藻中， PSI復合物由PSI核心復合物（PSI-CC）和捕光色素蛋白復合體 I （LHCI）兩部分組成［2］。真核生物的PSI復合物包括了一系列捕光葉綠素a/b結合蛋白即LHCI， 它們結合大約100個葉綠素分子以增大捕光截面， 并且因為含有葉綠素 b和類胡蘿卜素而可以捕獲光譜中不同波長的光［2-3］。通常 LHCI含有Lhca1、Lhca2、Lhca3和Lhca4捕光蛋白， 由核基因編碼， 分子量在20～29 kD之間， 在細胞質中合成后在引導肽的作用下被運輸進葉綠體并整合到類囊體膜上［2，4］。根據熒光發射波長的不同， LHCI又分為LHCI-730和LHCI-680兩部分， 其中LHCI-730是由Lhca1和 Lhca4形成的異源二聚體； LHCI-680由Lhca2和Lhca3形成的同源二聚體［5］。近年來在擬南芥、水稻和楊樹中， 又發現了Lhca基因的2個新類型Lhca5和Lhca6， 但因表達量非常低， 導致其在以往的研究中被忽略［6-8］。

與PSII相比， PSI在植物上的研究較少， 主要是以菠菜、豌豆和大麥等植物為試驗材料， 研究其蛋白組成、基因結構和結構生物學［9-10］。高榮孚等［11］研究油松上的PSI發現存在2種PSI。有報道稱， PSI相對于PSII對逆境脅迫抵抗性強， 是某些環境脅迫的最初作用部位［12］。作為PSI中最重要的功能蛋白之一， LHCI蛋白目前的研究主要集中在光能的捕獲與傳遞方面［13］， 涉及物種較少， 而且基因結構、編碼蛋白的生化特性、進化關系及脅迫應答等方面的研究報道尚少。

甘蔗（Saccharum officinarum L.）是我國和全世界主要的糖料作物和能源作物［14］， 同時， 甘蔗的光飽和點高， 屬高光效C4作物。高產、高糖和抗逆等農藝性狀形成的分子機制一直是甘蔗基礎研究中的熱點。本研究從甘蔗葉片cDNA文庫［15］中獲得了甘蔗PSI的Lhca3編碼序列， 運用生物信息學方法預測該基因的結構和功能， 明確了該基因編碼蛋白的亞細胞定位， 并利用實時熒光定量PCR技術研究了該基因在不同組織中以及不同逆境脅迫下的表達模式，為進一步研究Lhca家族基因在甘蔗PSI中的功能提供了試驗依據。

1　材料與方法

1.1材料及處理方法

甘蔗葉片 cDNA文庫、供試甘蔗品種熱帶種Badila和健康本氏煙苗株， 均由福建農林大學農業部福建甘蔗生物學與遺傳育種重點實驗室提供［15］。

使用Badila組培苗研究目的基因受不同外源脅迫后的表達特性。參照侯朝祥等［16］方法， 采用腋芽快繁技術培養Badila組培苗。待苗株高15～25 cm、出現4～5片完全展開葉時， 轉移到清水中培養， 28℃下光照16 h/黑暗8 h， 復性培養1周。選取長勢一致的幼苗， 進行黑暗（1、3、6和12 d）、重金屬鎘（50 μmol L-1CdCl2， 12、24和48 h）、過氧化氫（10 mmol L-1H2O2， 3、12和24 h）、ABA （100 μmol L-1ABA， 3、12和24 h）、高鹽（250 mmol L-1NaCl， 6、12和24 h）和模擬干旱（25% PEG-8000， 6、12和24 h）脅迫處理，每個處理3個重復， 每個重復3株， 以正常生長條件下的甘蔗幼苗作為對照。另外， 在田間隨機選取 9株處于分蘗期且長勢一致健康的Badila植株， 分成3組， 每組3株。取其白色嫩根、心葉（未展開的葉）、+1葉（甘蔗最高可見肥厚帶的第一葉）、側芽、葉鞘和蔗莖， 用于研究目的基因的空間表達特性。取樣后立即將樣品用液氮速凍， 置-80℃冰箱保存備用。

1.2總RNA提取和cDNA合成

采用 TRIzol試劑提取樣品總 RNA， 取 1.0 μL RNA， 以 1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測 RNA質量。使用 Nanodrop （Thermo Scientific， USA）測定RNA的濃度， 按照Prime Script RT Reagent Kit使用說明書，將RNA反轉錄成cDNA。

1.3甘蔗ScLhca3基因序列的獲得和生物信息學分析

對甘蔗葉片cDNA文庫進行大規模測序和生物信息學分析［15］。挑取含有目的基因的克隆測序， 獲得目的基因的序列。利用NCBI的ORF finder軟件，分析所獲cDNA序列的開放閱讀框及其推測氨基酸序列， 利用 ProtParam （http：//expasy.org/tools/prot param.html）預測一級結構， 利用 SignalP 4.1 Server （http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）進行信號肽分析， 利用TMHMM Server v. 2.0 （http：//www.cbs. dtu.dk/services/TMHMM/）進行跨膜結構域分析， 利用 Cell-PLoc （http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc/）進行亞細胞定位分析， 利用 Motif Scan （http：//prosite.expasy.org/）和Inter Proscan （http：//www. ebi.ac.uk/interpro/scan.html）進行功能結構域分析，利用DNAMAN進行多序列比對， 利用ClustalX和MEGA5.1構建系統進化樹。

1.4ScLhca3蛋白的原核表達

根據測序獲得ScLhca3的開放讀碼框（ORF）， 設計帶有合適酶切位點的特異性引物（表 1）， 以ScLhca3質粒為模板， 擴增并回收目的基因片段。回收產物經BamH I和EcoR I酶切后， 用T4 DNA連接酶連接到同樣雙酶切的原核表達載體 pGEX-6P-1，然后轉化至大腸桿菌 DH5α感受態細胞， 進行陽性克隆子篩選， 提取陽性克隆質粒用BamH I和EcoR I雙酶切鑒定， 將陽性克隆送上海生物工程有限公司測序， 測序結果正確的陽性克隆即為重組質粒， 命名為pGEX-6P-1-ScLhca3。將空質粒pGEX-6P-1和重組質粒 pGEX-6P-1-ScLhca3轉化入大腸桿菌Rosetta （DE3）中， 挑取單菌落， 接種至含有氨芐青霉素（50 mg L-1Amp+）的LB液體培養基中， 37℃培養過夜。取1 mL培養物接種至20 mL LB液體培養基（含50 mg L-1Amp+）中培養至OD600為0.6時， 加入終濃度為1 mmol L-1的IPTG， 37℃誘導12 h， 每2 h取樣1 mL。分別取樣品300 μL， 4℃8000 ×g離心10 min后收集菌體， 加入30 μL蛋白上樣緩沖液， 沸水浴5 min， 常溫下12 000 × g離心5 min， 取10 μL上清液經12% SDS-PAGE電泳檢測融合蛋白的表達。

1.5ScLhca3蛋白的亞細胞定位

以ScLhca3-GFP-F和ScLhca3-GFP-R為引物（表1）， ScLhca3質粒為模板， 擴增ScLhca3完整的ORF。PCR產物經Xba I與BamH I雙酶切后， 連入同樣雙酶切處理的亞細胞定位載體 pCAMBIA1302， 轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞， 經PCR、雙酶切和測序鑒定后， 得到植物表達載體 pCAMBIA1302-ScLhca3。按照Green等［17］的方法將植物表達載體轉入農桿菌 EHA105， 通過菌落 PCR鑒定重組農桿菌。然后取健康的本氏煙葉片， 參照 Sparkes等［18］農桿菌侵染方法， 將重組農桿菌注射入健康的本氏煙葉片， 48 h后在激光共聚焦顯微鏡（Leica TCS SP5 II）下觀察本氏煙葉片表皮細胞中 ScLhca3蛋白的定位結果。

1.6甘蔗ScLhca3基因的實時熒光定量PCR表達分析

根據ScLhca3基因的ORF序列， 設計特異性實時熒光定量PCR引物， 以Badila各組織及各脅迫后的葉片cDNA為模板， 以GAPDH基因（表1）為內參基因［19］， 按照 SYBR Green PCR Master Mix Kit （Roche）說明書配置定量反應體系。實時熒光定量PCR擴增程序為： 50℃ 2 min； 95℃ 10 min； 95℃ 15 s、60℃1 min，循環40次。每個樣品設置3次重復，以無菌水作對照， 采用 2-ΔΔCt算法進行基因表達水平分析［20］。

表1　實驗中用到的擴增引物Table 1 Primers used in this study

2　結果與分析

2.1ScLhca3基因的獲得與生物信息學分析

在對甘蔗葉片cDNA文庫大規模測序的過程中，發現了1個與玉米基因（XM_008660371.1）同源性高達 96%的基因片段， 序列分析顯示， 該基因片段長1009 bp， 包含一個804 bp的ORF， 編碼267個氨基酸（圖 1）， 被命名為 ScLhca3 （GenBank登錄號為KU215669）。

ProtParam分析表明， ScLhca3基因編碼的蛋白的分子量為 28.91 kD， 等電點為 8.96， 不穩定系數為 36.56， 脂溶指數為 83.75， 總平均疏水性是-0.068，表明該蛋白可能是一種親水蛋白。利用 SignalP 4.1 Server在線軟件對ScLhca3蛋白的信號肽預測表明，該蛋白不含信號肽， 是非分泌蛋白。根據 TMHMM Server v. 2.0在線分析， ScLhca3蛋白具有3個明顯的跨膜區域， 分布在第95～121、第137～160、第220～249位區域， 膜向性分別為 i→o、o→i、i→o。用Cell-PLoc進行亞細胞定位分析表明， ScLhca3蛋白定位于葉綠體。使用 Inter Proscan和Motif Scan在線分析軟件對 ScLhca3蛋白進行分析， 顯示第55～238位包括一個典型的捕光葉綠素a/b結合蛋白功能域（chlorophyll a/b binding domain）； 第8～10、第25～27、第 208～210和第 263～265位為蛋白激酶 C的磷酸化位點（protein kinase C phosphorylation site）；第58～61、第76～79和第208～211位為酪蛋白激酶II磷酸化位點（Casein kinase II phosphorylation site）；第62～67、第104～109和第237～242位為N-肉豆蔻酰位點（N-myristoylation site）。

圖1　獲得的ScLhca3基因的cDNA全長序列及其氨基酸序列Fig. 1 cDNA sequence and amino acid sequence of ScLhca3 gene obtained*終止密碼子。*stop codon.

2.2ScLhca3蛋白的氨基酸同源性分析

使用NCBI網站的Blastp搜索ScLhca3的同源序列， 選擇玉米（Zea mays， XP_008658593.1）、谷子（Setaria italica， XP_004965906.1）、水稻（Oryza sativa，BAD25284.1）、二穗短柄草（Brachypodium distachyon，XP_010233979.1）、烏拉爾圖小麥（Triticum urartu，EMS56059.1）、擬南芥（Arabidopsis thaliana， NP_ 001185280.1）、大豆（Glycine max， NP_001276264.1）、葡萄（Vitis vinifera， XP_002273201.1）、鹽芥（Eutrema halophilum， BAJ33764.1）、豌豆（Pisum sativum，AAA84545.1）的 Lhca3蛋白序列進行氨基酸同源性分析。結果如圖2所示， 甘蔗 ScLhca3蛋白與其他物種Lhca3蛋白在N端保守性較差， C端有較大的保守性， 且與玉米、谷子、水稻、烏拉爾圖小麥和二穗短柄草的蛋白相似度分別為 98.5%、98.8%、82.1%、81.4%和81.7%， 表明ScLhca3基因編碼的氨基酸序列與單子葉植物的同源性較高。

以萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii， XP_ 001701405.1）的Lhca3蛋白序列作為外源序列， 使用ClustalX和 MEGA5.1軟件， 采用 NJ法（BootStrap 1000）構建進化樹， 分析 ScLhca3蛋白與其他物種Lhca3蛋白的進化關系， 結果如圖3所示。單子葉植物和雙子葉植物的 Lhca3蛋白明顯屬于兩大不同的分支， 且在單子葉植物分支中， 甘蔗與同屬 C4植物的玉米和谷子為同一分支， 而同屬C3植物的水稻、小麥和二穗短柄草為另一分支。這表明， 該基因在遺傳進化上具有明顯的種屬差異性， 它們對應的蛋白屬于同一個家族。

2.3ScLhca3蛋白的原核表達分析

將重組質粒測序， 并用BamH I和EcoR I雙酶切電泳檢測。從圖4泳道 2中可以看出， 重組質粒經過雙酶切之后電泳結果出現5000 bp左右的載體片段和 800 bp左右的目的基因， 結合測序結果證明，ScLhca3和表達載體pGEX-6P-1重組成功。圖5中重組質粒 SDS-PAGE電泳結果顯示， 在分子量 54 kD左右處可見一條特異性條帶， 且隨誘導時間的延長， 蛋白濃度逐漸增加。ScLhca3蛋白約為28.91 kD，加上pGEX-6P-1載體上26 kD大小的GST標簽蛋白，因此與預測的蛋白大小基本相符， 可以確定該融合蛋白成功表達。

圖2　甘蔗ScLhca3蛋白與其他植物種蛋白的氨基酸序列比對Fig. 2 Homology analysis of sequences from sugarcane ScLhca3 and those of other species

2.4ScLhca3蛋白的在本氏煙細胞中的定位

重組熒光定位表達載體 pCAMBIA1302-ScLhca3經酶切和測序驗證后（圖 4泳道 1）， 轉化到農桿菌EHA105中， 通過煙草瞬時表達體系表達了ScLhca3 和GFP的融合蛋白， 于激光共聚焦顯微鏡下觀察融合蛋白綠色熒光在細胞中的分布， 結果如圖6所示。對照GFP在煙草表皮細胞中大量表達， 綠色熒光信號在細胞質、質膜和細胞核中均有分布； 而ScLhca3-GFP融合蛋白主要定位于葉綠體中， 定位結果與生物信息學分析預測一致。

2.5ScLhca3基因的組織特異性表達分析

基于實時熒光定量PCR技術， 以心葉的表達量為參照基準， 采用2-ΔΔCt法對甘蔗各組織ScLhca3基因表達量的分析結果如圖 7所示。ScLhca3基因的表達具有明顯的組織特異性， 在不同組織中的表達量差異較大， 其中在成熟葉片中相對表達量最高，側芽、心葉和葉鞘中次之， 莖中微量表達， 根中幾乎不表達。

2.6ScLhca3基因在不同外源脅迫下的表達特性分析

根據熒光定量PCR的數據分析ScLhca3基因在不同外源脅迫下的相對表達量， 如圖 8所示。ScLhca3能夠被CdCl2、H2O2和ABA強烈誘導上調表達。不同的是， 在CdCl2和H2O2脅迫下， ScLhca3的表達量均在12 h達到最大值， 隨后下降， 呈上調和恢復的模式， 但從總體看來均高于對照； 而在ABA條件下， ScLhca3的表達量則隨時間的增加而增加。另外， 在黑暗、PEG和NaCl脅迫下， ScLhca3基因的相對表達量顯著下調。其中， 在PEG和NaCl脅迫下， ScLhca3的表達量急劇下降； 在黑暗條件下，ScLhca3的表達量則隨時間的增加呈逐漸下降趨勢。

圖3　不同物種Lhca3基因編碼蛋白的系統進化分析Fig. 3 Phylogenetic analysis of proteins encoded by Lhca3 gene from different plant species

圖5　pGEX-6P-1-ScLhca3原核表達產物的SDS-PAGE分析Fig. 5 Analysis of prokaryotic expression of pGEX-6P-1-ScLhca3 by SDS-PAGEM： 蛋白質分子質量標準； A： 未誘導空質粒； B： IPTG 誘導12 h后的空質粒； C： 未誘導重組質粒； D～H： IPTG分別誘導2、4、6、8、10和12 h后的重組質粒。M： protein molecular weight marker； A： pGEX-6P-1 without induction； B： pGEX-6P-1 after inducing for 12 hours；C： pGEX-6P-1-ScLhca3 without induction； D-H： pGEX-6P-1-ScLhca3 after inducing for 2， 4， 6， 8， 10， and 12 hours，respectively.

3　討論

光合作用是光合生物（包括綠色植物、藻類和某些細菌）體內最為重要的同化作用， 是地球上所有生命現象的能量和物質基礎。PSI作為光合作用過程中最重要的復合物之一， 在電子轉移、抵抗逆境及狀態轉換等方面起著重要的作用［2，12］。LHCI蛋白作為PSI中重要的組成部分， 通過與葉綠素結合在光合作用中發揮作用［6，13］。本研究以具有高光效特性的C4植物甘蔗為試驗材料， 獲得了 ScLhca3基因。生物信息學分析表明， 該基因所編碼的蛋白包含一個典型的植物捕光葉綠素 a/b結合蛋白的功能域， 推測其可能在與色素分子結合的過程發揮作用； 具有蛋白激酶C的磷酸化位點、酪蛋白激酶II磷酸化位點、N-肉豆蔻酰位點， 這可能與該基因轉錄后的調節有關［21］。以Lhca3蛋白序列為基礎的進化樹表明，該基因在進化過程中呈現出明顯的分支， 種屬差異性顯著。同時， 在單子葉的C4植物分支中， ScLhca3基因與玉米在同一分支， 親緣關系最近， 表明該基因在近緣物種間的保守性更高。蛋白執行功能與其能否處于正確的場所密切相關。農桿菌侵染煙草試驗證實了 ScLhca3蛋白定位在葉綠體， 與預測結果一致， 為 ScLhca3蛋白與色素分子結合參與光合作用的研究提供了依據。

圖6　pCAMBIA1302-ScLhca3在本生煙表皮細胞中的定位Fig. 6 Subcellular localization of ScLhca3 fused with GFP in the epidermal cells of N. benthamianaScLhca3-GFP的定位如箭頭所示； A： GFP對照； B： 葉綠體； C： GFP空載的明場； D： GFP空載的疊加場； E： ScLhca3-GFP； F： 葉綠體；G： ScLhca3-GFP的明場； H： ScLhca3-GFP的疊加場。Bars： 50 μm。The ScLhca3-GFP was labled by arrows； A： GFP control； B： Chloroplast； C： GFP vision under natural light； D： GFP overlapped vision of A， C，and B； E： ScLhca3-GFP； F： Chloroplast； G： ScLhca3-GFP vision under natural light； H： ScLhca3-GFP overlapped vision of E， F， and G. Bars： 50 μm.

圖7　ScLhca3基因在甘蔗不同組織中的表達Fig. 7 Relative expression of ScLhca3 gene in different sugarcane tissues誤差線為每組處理的標準誤差（n = 3）。The error bar represents the standard error of each treating group （n = 3）.

組織特異性表達分析表明， ScLhca3在甘蔗成熟葉片中的表達量最高， 側芽、心葉、葉鞘和莖中次之， 根中最低， 這一表達規律與Frank等［7］的研究結果是一致的， 并且這種分布與LHC作為捕光色素結合蛋白基因在光合作用的光反應場所——葉綠體的類囊體中表達的結論相符［2］。光合作用主要發生在植物的葉片中， 大量的光能通葉片吸收， 根中幾乎不接收光， ScLhca3在甘蔗成熟葉片中的大量表達，根中幾乎不表達， 暗示了該基因可能為植物光合作用所必需。目前， 在擬南芥中Lhca1、Lhca2、Lhca3 和 Lhca4基因都是以單拷貝形式存在于基因組， 以二聚體形式單獨地結合 PSI［7］， 而在甘蔗中， Lhca3基因以何種形式結合在PSI上， 有待深入研究。

在Lhc基因家族中， PSII中Lhcb基因的表達受多種逆境脅迫的調控（如氧脅迫、鹽脅迫和激素信號ABA［22-23］）， 但關于PSI中Lhca基因在逆境脅迫條件下的應答調控鮮有報道。本研究表明， CdCl2、H2O2和 ABA均可誘導 ScLhca3基因的上調表達， 推測該基因可能在甘蔗抗重金屬、氧脅迫和 ABA 信號通路中具重要的保護功能。有研究表明， 植物對重金屬的富集能力與能量代謝密切相關［24］。甘蔗作為一種潛在的耐重金屬脅迫的超富集植物［25］， 這種特性必然與其是高光效C4作物相關， 而ScLhca3基因是否在甘蔗這種特性中發揮關鍵性作用， 目前尚不清晰， 需要進一步的試驗驗證。另外， 在黑暗、PEG和NaCl脅迫條件下， ScLhca3基因的表達量顯著下降， 這可能是影響了葉綠素的合成和葉綠體的正常生理狀態， 進而影響了光合作用［26-27］， 致使甘蔗體內 Lhca3基因的需求量降低。這是關于甘蔗Lhca基因家族在脅迫應答方面的首次報道， 為深入研究Lhca基因的功能提供了條件。有趣的是， 本研究還發現， 在鎘脅迫、氧脅迫、鹽脅迫、黑暗脅迫和干旱脅迫條件下， 對 ScLhca3基因表達量的影響與前人對PSII中Lhcb基因的研究結果一致［22-23，28-30］；而在PSII中， ABA對Lhcb mRNA具有負調控作用［31］，與我們對PSI中ScLhca3的研究結果明顯不同。這表明， Lhca基因和Lhcb基因的表達既存在功能上的相似性又有其各自的特異性， 同時， 也體現了 PSI 和PSII在光合作用以及對逆境脅迫的適應中可能發揮不同的作用。因此， ScLhca3的克隆為研究 Lhca家族基因在甘蔗中的功能創造了條件， 為進一步研究甘蔗高效光合作用的分子機制奠定了基礎， 同時，也為研究甘蔗耐重金屬脅迫提供了新的方向。

圖8　甘蔗ScLhca3基因在不同外源脅迫下的表達Fig. 8 ScLhca3 gene expression of sugarcane under different exogenous stressesA： ScLhca3基因在黑暗脅迫下的表達； B： ScLhca3基因在CdCl2脅迫下的表達； C： ScLhca3基因在H2O2和ABA脅迫下的表達；D： ScLhca3基因在NaCl和PEG脅迫下的表達； 誤差線為每組處理的標準誤差（n = 3）。A： ScLhca3 gene expression of sugarcane under Darkness stress； B： ScLhca3 gene expression of sugarcane under CdCl2stress； C： ScLhca3 gene expression of sugarcane under H2O2and ABA stress； D： ScLhca3 gene expression of sugarcane under NaCl and PEG stress. The error bar represents the standard error of each treating group （n = 3）.

4　結論

本研究克隆了甘蔗Lhca3基因（GenBank登錄號為KU215669）。該基因編碼的蛋白被定位于葉綠體，無信號肽， 存在3個明顯的跨膜區域， 是一種親水性非分泌膜蛋白。ScLhca3的表達具有明顯的組織特異性， 對干旱、黑暗、鹽、重金屬鎘、過氧化氫以及ABA脅迫均有表達響應， 表明它可能參與甘蔗的抗逆應答。

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Cloning and Characterization of Light Harvesting Chlorophyll a/b-Binding Protein Coding Gene （ScLhca3） in Sugarcane

ZHAI Yu-Shan， DENG Yu-Qing， DONG Meng， XU Qian， CHENG Guang-Yuan， PENG Lei， LIN Yan-Quan*，and XU Jing-Sheng*

Fujian Agriculture and Forestry University / Key Laboratory of Sugarcane Biology and Genetic Breeding， Ministry of Agriculture， Fuzhou 350002，China

The Lhca gene family in green plants encodes several light-harvesting chlorophyll a/b-binding proteins that harvest and transfer light energy to the reaction center of photosystem I （PSI） in photosynthesis. The cDNA sequence of Lhca3 gene was firstly obtained from sugarcane leaf full-length cDNA library through sequencing and validated by homology comparison. It was designated ScLhca3 and submitted to the GenBank （accession number： KU215669）. ScLhca3 contains an 804 bp open reading frame （ORF） and encodes a deduced protein of 267 amino acids， with a molecular weight and pI of 28.91 kD and 8.96，respectively. Bioinformatics analysis showed that ScLhca3 is a hydrophilic non-secretory protein with three transmembrane domains and a chlorophyll a/b binding domain. Sequence multi-alignment and phylogenetic analysis demonstrated that the ScLhca3 protein sequence shared a high identity with Lhca3 from other plants， with the specificity of species. The protokaryotic expression vector pGEX-6P-1-ScLhca3 was constructed and expressed in E. coli cells under the induction of IPTG. The subcellular localization experiment showed that the ScLhca3 fused with GFP， a reporter protein， was located on chloroplast. Real-time quantitative PCR analysis showed the expression of ScLhca3 had a clear tissue specificity， and was upregulated by CdCl2， ABA， and H2O2， but downregulated by darkness， NaCl， and PEG.

Sugarcane； Photosystem I； Light harvesting chlorophyll a/b-binding protein； Real-time quantitative PCR

10.3724/SP.J.1006.2016.01332

本研究由國家高技術研究發展計劃（863計劃）項目（2013AA102604）， 國家自然科學基金項目（31171605， 31371688）和國家現代農業產業技術體系建設專項（CARS-20-1-1）資助。

This study was supported by the National High-tech Research and Development Program of China （2013AA102604）， the National Natural Science Foundation of China （31171605， 31371688）， and the China Agriculture Research System （CARS-20-1-1）.

（Corresponding authors）： 林彥銓， E-mail： zwlinyq@163.com； 徐景升， E-mail： xujingsheng@126.com， Tel： 13959174787

聯系方式： E-mail： yushanzhai@126.com， Tel： 18450077687

Received（）： 2016-01-11； Accepted（接受日期）： 2016-05-09； Published online（網絡出版日期）： 2016-05-30.

URL： http：//www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20160530.0905.002.html