轉基因雞的染色體核型分析

李鵬姍，雷雪芹,2，徐廷生,2，趙淑娟,2，王攀林

(1.河南科技大學 動物科技學院，河南 洛陽 471003；2.洛陽市優質禽類種質資源與遺傳繁育重點實驗室，河南 洛陽 471003)

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轉基因雞的染色體核型分析

李鵬姍1，雷雪芹1,2，徐廷生1,2，趙淑娟1,2，王攀林1

(1.河南科技大學 動物科技學院，河南 洛陽 471003；2.洛陽市優質禽類種質資源與遺傳繁育重點實驗室，河南 洛陽 471003)

為了研究外源基因p53對雞自身染色體核型是否有影響，以含有外源基因p53的轉基因公雞為試驗組，以同種非轉基因公雞作為對照組，通過外周血淋巴細胞培養法和骨髓法，制備了雞染色體標本片。在油鏡下隨機選擇50個染色體分散良好的細胞，測量染色體的條數、相對長度、臂比值和著絲粒指數，確定并比較轉基因雞和非轉基因雞的染色體形態。研究結果表明：試驗組和對照組公雞的染色體條數均符合2n=78條，均包括10對大染色體和29對微小染色體，且微小染色體基本為端著絲粒染色體。兩組的染色體核型均由 38 對常染色體和1對同配型性染色體ZZ組成，1 號染色體、2號染色體和1對性染色體(ZZ)均為中央著絲粒(m)染色體，3號染色體均為端著絲粒(t)染色體，4號染色體均為亞中央著絲粒(sm)染色體，6～10號染色體均為端著絲粒(t)染色體。

轉基因雞；非轉基因雞；外周血淋巴細胞培養法；骨髓法；染色體核型分析

0　引言

由于禽類的生殖特點，導致轉基因禽類的研究技術滯后于轉基因哺乳類動物。轉基因雞作為重要的經濟動物和理想的生物反應器，具有廣闊的應用前景[1]。從禽蛋中收集和分離轉基因蛋白質較其他方法更容易，且轉基因產物不容易受到污染。在得到轉基因產物的過程中，不會影響雞自身的生長發育和健康，故可以利用轉基因雞生產大量藥用蛋白。與哺乳動物生物反應器相比，雞輸卵管生物反應器因其經濟、高效、穩定和周期短等多個潛在優勢，被認為是具有開發前景的生產藥用蛋白的技術平臺之一[2]。文獻[3-4]分別用不同的方法成功制備了轉基因雞。

p53基因是人體細胞中的一種抑癌基因，幾乎所有的體細胞中均可檢測到p53蛋白的存在[5]。此外，p53基因的成功克隆以及載體的構建為轉基因動物模型的建立奠定了一定基礎[6]。為了進一步確定轉入的外源基因p53是否對雞自身的染色體核型有影響，本文對體內已檢測出含有外源基因p53的轉基因公雞進行核型分析，并比較轉基因公雞和非轉基因公雞的染色體形態結構，了解轉基因雞染色體形態變化特征。

1　試驗材料與方法

1.1試驗動物

成年轉基因公雞(經檢測含有外源基因p53)和非轉基因公雞由河南科技大學試驗牧場提供，品種為海蘭褐殼蛋雞。5～10日齡的轉基因公雞(經檢測含有外源基因p53)和非轉基因公雞由洛陽市優質禽類遺傳繁育重點實驗室提供，品種為海蘭褐殼蛋雞。

1.2主要試劑與儀器

組織培養液1640，北京賽默飛世爾生物化學制品有限公司；植物血凝素(phytohemagglutinin，PHA)和秋水仙堿，北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司；800-電動離心機，金壇市新航儀器廠；數顯恒溫水浴鍋，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；雙目顯微鏡，上海彼愛姆光學儀器制造公司；恒溫培養箱，上海賀得實驗設備有限公司。

1.3試驗方法

1.3.1外周血淋巴細胞培養法制備染色體標本片

將4mL組織培養液1640、0.032gNaHCO3粉末、1mL胎牛血清、1mg/mL的PHA0.833mL、500IU/mL的肝素鈉0.005mL和適量雙抗，一并加入培養瓶內，用質量分數為0.5%的NaHCO3溶液調節培養液pH值為7.2～7.4。用生物濾膜過濾并分裝于滅過菌的培養瓶中，蓋緊瓶塞。用肝素抗凝劑潤濕注射器管壁，從雞翅下靜脈采血1mL，在約5mL培養基中加入全血0.3～0.5mL，置于39 ℃恒溫培養箱中培養56～72h。培養結束前2～3h，加入秋水仙堿。培養結束后，經過低滲、預固定、固定、重復固定、滴片和染色等操作制備染色體標本片，通過10×100倍油鏡鏡檢觀察。

1.3.2骨髓法制備染色體標本片

取5～10日齡的轉基因雛雞，稱其質量，后腹腔注射20μg/g秋水仙堿，處理2.0～2.5h。心臟壓迫法猝死雛雞，取整條雞腿，去毛皮及其肌肉組織，取其股骨，剪去股骨兩端，用10mL注射器抽取0.075mol/L的KCl溶液約5mL，反復沖洗股骨骨髓腔直至骨髓腔變白。以10mL玻璃離心管盛接細胞懸液，1 000r/min離心10min，棄上清液。標本片的制作同外周血淋巴細胞培養法。

1.3.3染色體核型分析方法

在10×100倍油鏡下各隨機選擇50個染色體分散相良好的細胞，觀察染色體的條數，最后得出轉基因雞和對照組雞的染色體數目。再分別選擇10個分散相良好的中期染色體，進行攝影，照片放大，打印，用游標卡尺直接測量前10對大染色體長度、長臂長度和短臂長度。通過文獻[7]中的方法計算前10對大染色體的相對長度、臂比值和著絲粒指數，對染色體進行核型分析。

圖1　外周血淋巴細胞培養法制備的轉基因雞染色體標本片

圖2　骨髓法制備的轉基因雞染色體標本片

2　結果與分析

2.1染色體標本片的制備

2.1.1外周血淋巴細胞培養法制備染色體標本片

在轉基因雞外周血培養過程中，PHA的用量、秋水仙堿的用量、作用時間和溫度對其淋巴細胞的增殖和分裂尤為重要。通過濃度梯度的設置，確定試驗所用PHA的質量濃度為0.18mg/mL,秋水仙堿的處理時間為3h、質量濃度為0.05μg/mL,培養溫度為(39.0±0.5) ℃,總培養時間為 72h，成功制備出了轉基因雞的染色體標本片，如圖1所示。從圖1中可以看到：轉基因雞染色體的大致形態及長度，但無法判斷其著絲粒的具體位置，不能進行有效的染色體核型分析及核型圖的制備。

2.1.2骨髓法制備染色體標本片

在利用骨髓法制備轉基因雞的染色體標本片中，秋水仙堿的用量和作用時間對是否能得到大量處于分裂中期的細胞有很大影響。經過濃度梯度的設置，確定秋水仙堿的用量為20μg/g，處理活體雛雞的時間為2h，得到大量處于分裂中期的骨髓細胞，且染色體形態清晰，分散相良好，標本片如圖2所示。通過圖2可以清楚看到：轉基因雞的染色體形態和著絲粒的位置，可以進行后續的染色體核型分析和核型圖的繪制。

采用兩種不同的方法制備雞染色體標本片，對試驗步驟、試驗條件和制片結果比較得出：骨髓法制備雞染色體標本片比外周血淋巴細胞培養法制備雞染色體標本片更有優勢。

由于轉基因雞的數量有限，本試驗采用骨髓法制備了轉基因公雞和非轉基因公雞的染色體標本片，并進行了染色體核型分析。

2.2二倍體(2n)細胞染色體數目

本試驗隨機選取轉基因公雞和非轉基因公雞的骨髓細胞各50個，觀察并計算每個骨髓細胞的染色體數目，結果見表1。由表1可以看出:轉基因公雞的染色體數目2n=78；非轉基因公雞的染色體數目2n=78。

表1　轉基因公雞和非轉基因公雞骨髓細胞染色體數目

2.3染色體核型分析

對轉基因公雞和非轉基因公雞的前10對大染色體(包括1對性染色體)進行了染色體長度、長臂長度和短臂長度的測量。分別選取了10個分散相相對良好的分裂相進行測量，并求其均數和標準差，對照文獻[7]的標準對轉基因公雞和非轉基因公雞的染色體核型進行分類，結果如表2和表3所示。

注：“Z”為單條性染色體；“m”為中著絲粒；“t”為端著絲粒；“sm”為亞中央著絲粒。

表3　非轉基因公雞的大染色體核型特征(均數±標準差)

注：“Z”為單條性染色體；“m”為中著絲粒；“t”為端著絲粒；“sm”為亞中央著絲粒。

由表2的結果可以確定轉基因公雞的前10對大染色體的染色體形態，其中，1 號染色體、2 號染色體和1對性染色體(ZZ)為中央著絲粒(m)染色體，3號染色體為端著絲粒(t)染色體，4號染色體為亞中央著絲粒(sm)染色體，6～10號染色體為端著絲粒(t)染色體。由表3的結果可以確定非轉基因公雞的10對大染色體的染色體形態，其中，1 號染色體、2 號染色體和1對性染色體(ZZ)為中央著絲粒(m)染色體，3號染色體為端著絲粒(t)染色體，4號染色體為亞中央著絲粒(sm)染色體，6～10號染色體為端著絲粒(t)染色體。

由表2和表3可知：轉基因公雞的單條性染色體(Z)的平均相對長度為(10.32±0.63)%，非轉基因公雞的單條性染色體(Z)的平均相對長度為(10.26±0.26)%，差異不大。其余9對常染色的平均相對長度也無明顯差異。

根據表2和表3的測量結果，分別繪制了轉基因公雞和非轉基因公雞的染色體核型圖，結果如圖3和圖4所示。通過圖3和圖4可以更加直觀地觀察到轉基因公雞和非轉基因公雞前10對大染色體的核型形態特征。

圖3轉基因公雞染色體核型圖圖4非轉基因公雞染色體核型圖

3　討論

3.1雞染色體標本片制備方法

在雞外周血培養過程中，通過數次的重復培養，成功制備出了轉基因雞的染色體標本片。培養過程中各試劑的用量與處理時間參照文獻[8-10]稍做改進，在其基礎上探索更適合轉基因雞的培養方法。因為是不同的雞種，對培養環境的要求會稍有不同。本文雖用外周血淋巴細胞培養法成功制備出了染色體標本片，但制片質量不佳。文獻[11]曾指出在雞染色體研究中不常采用此法，因其對設備要求嚴格，操作復雜，易污染。可進一步探究更加適合該轉基因雞的外周血培養方法。

在骨髓法的探索中，采用 5～10 日齡的雛雞，秋水仙堿用量 20μg/g，秋水仙堿處理活體最佳時間為2h，與文獻[12]的試驗條件最接近；與文獻[13]報道所用15日齡雛雞，秋水仙堿用量3μg/g，處理活體3h不一致；與文獻[14]報道所用4月齡育成雞不一致；與文獻[15-16]報道秋水仙堿用量分別為10μg/g和2μg/g不一致。造成這些差異的原因可能是不同雞種和不同日齡的雞所適應的最佳處理時間和秋水仙堿用量不同。

無論是外周血淋巴細胞培養法還是骨髓法，都需要經過離心、低滲、預固定、固定、重復固定、滴片和染色等過程，通過不斷地探究找出同時適合兩種方法的最佳處理時間。每次以1 000r/min離心10min；低滲最佳溫度為 39 ℃，最佳處理時間為35min；預固定所用新配置固定液為1mL，時間為2min；固定的最佳時間為 30min。滴片的高度一定要大于30cm，才能得到大量分散良好的染色體標本，便于后續的觀察與測量。染色時間為30min，染色時間過短會造成染色體著色不明顯，不利于觀察。

3.2染色體核型

3.2.1染色體數目

本試驗所用轉基因公雞的二倍體染色體數目2n=78的細胞占所觀察細胞總數的78%，所得結果與文獻[17-19]研究結果接近。一般情況下認為：染色體眾數的細胞占被觀察細胞總數的75%以上，便可以確定試驗對象的二倍體染色體數目[20]。對于染色體2n≠78的細胞，可能是由于雞的染色體中微小染色體較多，不當的吹打和離心都會造成染色體的丟失，并且容易發生羅伯遜易位，滴片時微小染色體又極易隨液體漂流而造成丟失，此外，還容易將部分未溶解的染料顆粒及其他雜質誤認為是微小染色體。

3.2.2染色體形態

本試驗得出該轉基因公雞與非轉基因公雞的染色體核型并無明顯差異，說明外源基因p53對公雞自身的染色體核型沒有太大影響。此外，由于外源基因p53結構非常小，理論上能與雞的染色體結合形成環狀結構，因為雞的染色體只有前10對為大染色體，其余都為微小染色體。試驗結果為：該轉基因公雞的1 號染色體、2 號染色體和1對性染色體(ZZ)均為中央著絲粒(m)染色體，3號染色體為端著絲粒(t)染色體， 4號染色體為亞中央著絲粒(sm)染色體，6～10號染色體都為端著絲粒(t)染色體。這與其他文獻研究結果基本相似，也存在著一些不同。文獻[21]指出雞的1 號染色體為亞中央著絲粒(sm)染色體；文獻[17-18，22]指出2號染色體為亞中央著絲粒(sm)染色體；文獻[12，22-23]認為7號染色體為亞中央著絲粒(sm)染色體；文獻[24]指出 9 號染色體為亞中央著絲粒(sm)染色體。造成這些不同的原因可能與雞的品種不同有關。

4　結論

(1)成功制備出了轉基因公雞和非轉基因公雞處于分裂中期且分散良好、形態清晰的染色體標本片，為含有外源基因p53的轉基因雞的進一步研究奠定了基礎。

(2)含有外源基因p53轉基因公雞的染色體2n=78。染色體核型為：1 號染色體、2 號染色體和一對性染色體(ZZ)均為中央著絲粒(m)染色體，3號染色體為端著絲粒(t)染色體， 4號染色體為亞中央著絲粒(sm)染色體，6～10號染色體均為端著絲粒(t)染色體。

(3)含有外源基因p53的轉基因公雞染色體的相對長度、臂比值、著絲粒指數與非轉基因公雞基本一致，說明轉基因公雞與非轉基因公雞的染色體核型沒有明顯差異。

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河南省基礎與前沿技術研究計劃基金項目(072300430010);洛陽市重點科技計劃基金項目(1101033A)

李鵬姍(1991-),女,河南汝陽人,碩士生;雷雪芹(1962-),女,通信作者,河南洛寧人,教授,博士,碩士生導師,主要從事動物遺傳資源與分子生物學方面的教學和科研.

2016-03-28

1672-6871(2016)06-0077-05

10.15926/j.cnki.issn1672-6871.2016.06.016

S831

A