不同條件對蛇足石杉組培苗生長及石杉堿甲積累的影響

張小紅，李曉君，楊雪飛，羅建平

(合肥工業大學 生物與食品工程學院，安徽 合肥 230009)

·中藥農業·

不同條件對蛇足石杉組培苗生長及石杉堿甲積累的影響

張小紅，李曉君，楊雪飛，羅建平*

(合肥工業大學 生物與食品工程學院，安徽 合肥 230009)

目的：考察不同條件對蛇足石杉組培苗生長和石杉堿甲積累的影響。方法：通過添加不同濃度的組合激素、無機氮源、前體物、誘導子，考察其對蛇足石杉干重增長率和石杉堿甲含量的影響。結果：不同條件對蛇足石杉組培苗生長和石杉堿甲積累的影響不同，適當的組合激素和無機氮源利于蛇足石杉組培苗的生長，前體物和適當的誘導子利于石杉堿甲的積累。其中0.50 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1IBA的激素組合對蛇足石杉組培苗的生長促進效果最顯著，其干重增長率在培養12周時約是對照組的1.32倍，而0.5 mmol·L-1的賴氨酸對石杉堿甲積累的調控效果最好，與對照相比，在培養12周時，石杉堿甲含量提高了71.46%。結論：本研究初步實現了對蛇足石杉組培苗生長和石杉堿甲積累的調控，為通過千層塔的組織快繁緩解石杉堿甲的資源短缺提供了理論基礎。

蛇足石杉；激素；無機氮源；前體物；誘導子；石杉堿甲

蛇足石杉Huperziaserrata(Thumb)Trev屬石杉科、石杉屬，又名千層塔，是我國傳統名貴珍稀中草藥[1]，其有效成分石杉堿甲因其低毒、高效、選擇性強等優點已被國際列為第二代乙酰膽堿酯酶抑制劑之一[2-4]。以石杉堿甲為主要成分的藥物哈伯因與雙益平在臨床上已被用于治療老年癡呆、重癥肌無力、精神分裂等疾病[5-6]。隨著老齡化社會的到來，市場對于石杉堿甲的需求量逐年倍增。因石杉堿甲全合成困難，其衍生物及類似物的活性均不如天然石杉堿甲且價格高昂，導致現階段石杉堿甲的來源主要依賴野生蛇足石杉等極少種類的石杉科植物。而野生蛇足石杉生境特殊，生長緩慢，石杉堿甲含量低(僅為萬分之一)[2]等限制性因素加劇了石杉堿甲的供需矛盾。本文試圖通過添加外源激素、無機氮源、前體物、誘導子等方式，對蛇足石杉無菌組培苗進行培養，以期獲得一種能夠有效促進蛇足石杉生長、提高石杉堿甲含量的培養條件，為石杉堿甲的生產提供新途徑。

1 材料

1.1 材料供試

材料蛇足石杉Huperziaserrata(Thumb)Trev組培苗由合肥工業大學生物與食品工程學院中草藥與功能食品研究所提供，其誘導方法同前文[7]。蛇足石杉源植株由中國科學技術大學顧月華教授鑒定。

1.2 試劑

石杉堿甲標準品(≥98%，HPLC，成都瑞芬斯生物科技有限公司)；石斛寡糖素(實驗室制備)；大量元素、微量元素、有機元素、激素及其它化學藥品和試劑均為進口或國產分析純以上。

1.3 儀器

超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司 SW-CJ-1FD)；高效液相色譜儀(美國Agilent公司 1260)；高壓滅菌鍋(日本三洋公司 MLS-3750)；電子天平(梅特勒-托利有限公司)。

2 方法

2.1

培養基與培養條件實驗使用的基本培養基為含2%蔗糖的1/4MS培養基(pH 5.8)；培養基的滅菌條件是121 ℃、15 min；所有培養物均在25±2 ℃、12 h·d-1光照(50 μmol·m-2·s-1)下培養12周。

2.2

外源添加物實驗分別考察外源激素、無機氮源、前體物和誘導子對蛇足石杉組培苗生長和石杉堿甲積累的影響。

外源激素包括：不同濃度的6-BA(0、0.5、1.0 mg·L-1)和NAA(0、0.05、0.10、0.20 mg·L-1)的組合；以及不同濃度的6-BA(0、0.10、0.25、0.50、1.00 mg·L-1)和IBA(0、0.05、0.10、0.20 mg·L-1)的組合。

無機氮源處理分別為不同總氮濃度(10、15、20 mmol·L-1)下不同比例的NH4+和NO3-組合(只有NO3-、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、2∶1)。外源激素和氮源均在培養基配置時加入，并進行滅菌。

前體物處理時采用濃度分別為0、0.1、0.5和2.0 mmoL·L-1的賴氨酸(Lys)，采用過濾滅菌加入已滅菌的培養基中。

誘導子處理包括非生物誘導子硝普鈉(SNP)(0、10、50、200 μmol·L-1)和生物誘導子石斛寡糖素(0、2、10、40 mg·L-1)。誘導子的添加方式同Lys處理。

2.3 測定方法

蛇足石杉試管苗干重和石杉堿甲含量測定的取樣量及取樣方法均為每個處理接種5瓶，每瓶5株，重復實驗3次。

蛇足石杉干重增長率的測定：分別稱量蛇足石杉接種前的干重和培養后的干重，按如下公式計算干重增長率。

干重增長率(%)=(培養后干重-接種前干重)/ 接種前干重×100%

石杉堿甲含量采用HPLC測定方法，具體條件參照周小雷等方法[8]。色譜柱：PurospherRC18色譜柱(4.6×250 mm，i.d.，5 μm)(Merck)；流動相：甲醇-水(85∶15)；流速：0.3 mL·min-1；檢測波長：308 nm，柱溫：25 ℃；進樣量20 μL。

2.4 數據處理

采用Microsoft Excel 2003、Origin 7.0 軟件對數據進行處理和繪圖，采用SPSS 17.0 統計分析軟件對數據進行差異顯著性檢驗(Duncan法，顯著水平為P<0.05)，不同字母表示兩者之間具有顯著性差異。

3 結果與分析

3.1 石杉堿甲HPLC譜圖

與石杉堿甲標準品(圖1A)相比較，蛇足石杉組培苗甲醇提取物(圖1B)在HPLC圖譜中出現和石杉堿甲標準品保留時間相同的峰，說明蛇足石杉組培苗具有合成石杉堿甲的能力。

圖1 石杉堿甲標準品(A)和蛇足石杉組培苗甲醇提取物(B)HPLC色譜圖

3.2 外源激素對蛇足石杉組培苗生長及石杉堿甲積累的影響

在實驗濃度范圍內，只有0.5 mg·L-16-BA+0.05 mg ·L-1NAA組合對蛇足石杉組培苗的生長產生了促進作用，約是對照組的1.16倍，其他組合均呈現不同程度的抑制作用(圖2A)；與對照相比，1.0 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1NAA組合可顯著促進石杉堿甲的積累，其含量約是對照組的1.38倍，而其它組合均抑制蛇足石杉中石杉堿甲的積累(圖2B)。

圖2 不同濃度的6-BA與NAA組合對蛇足石杉干重增長率(A)及石杉堿甲含量(B)的影響

不同濃度的6-BA與IBA組合對蛇足石杉的生長和石杉堿甲含量呈現了不同的作用(圖3)。與對照組相比，除1.00 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1IBA 外，0.10 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1IBA、0.25 mg·L-16-BA+0.10 mg·L-1IBA、0.50 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1IBA 3組激素組合均顯著的促進蛇足石杉組培苗增長，其蛇足石杉干重增長率分別為對照組的1.14、1.30、1.32倍，而其余各組均對蛇足石杉的增長產生了抑制作用(圖3A)；與對照組相比，只有0.25 mg·L-16-BA+0.10 mg·L-1IBA、0.50 mg·L-16-BA+0.10 mg·L-1IBA、1.00 mg·L-16-BA+0.20 mg·L-1IBA 3組激素組合的石杉堿甲含量低于對照組，其余9組激素組合均顯著高于對照組，且石杉堿甲含量分別提高到對照組的1.22、1.30、1.54、1.44、1.12、1.24、1.50、1.43、1.56倍(圖3B)。

圖3 不同濃度的6-BA與IBA組合對蛇足石杉干重增長率(A)及石杉堿甲含量(B)的影響

3.3 無機氮源對蛇足石杉組培苗生長及石杉堿甲積累的影響

在本實驗濃度范圍內，不同比例的氮源對蛇足石杉生長和石杉堿甲積累的作用表現不同(圖4)。與對照(NH4+∶NO3-=1∶2)相比，10 mmol·L-1的總氮濃度抑制蛇足石杉生長或對其無影響，15 mmol·L-1的總氮濃度基本促進蛇足石杉生長，20 mmol·L-1的總氮濃度對蛇足石杉生長的影響結果差異化。(圖4A)；不同比例的NH4+∶NO3-對石杉堿甲的積累作用均呈現低濃度促進，高濃度抑制的“鐘罩型”劑量依賴關系，其最適比例為1∶5，與對照相比，在時10、15、20 mmol·L-1的總氮濃度時，石杉堿甲含量分別為對照的1.61、1.47、1.56倍(圖4B)。

圖4 無機氮源對蛇足石杉干重增長率(A)及石杉堿甲含量(B)的影響

3.4 前體物對蛇足石杉組培苗生長及石杉堿甲積累的影響

在本實驗濃度范圍內，賴氨酸(Lys)對蛇足石杉生長呈現低濃度促進，高濃度抑制的劑量關系，在最適濃度0.1 mmol·L-1時，蛇足石杉的干重增長率約是對照組的1.18倍。而在本實驗濃度范圍內，賴氨酸對石杉堿甲的積累產生了的促進作用，在最適濃度0.5 mmol·L-1時其石杉堿甲含量約是對照組的1.7倍(圖5)。

圖5 賴氨酸對蛇足石杉干重增長率及石杉堿甲含量的影響

3.5 誘導子對蛇足石杉組培苗生長及石杉堿甲積累的影響

在本實驗濃度范圍內，一氧化氮對蛇足石杉的生長和石杉堿甲的積累均呈現低濃度促進，高濃度抑制的劑量關系。在最適濃度10 μmol·L-1時，蛇足石杉干重的增長率和石杉堿甲含量對分別為照組的1.21、1.40倍(圖6)。

圖6 一氧化氮對蛇足石杉干重增長率及石杉堿甲含量的影響

在實驗濃度范圍內，寡糖素有利于促進蛇足石杉生長和石杉堿甲積累，且隨著寡糖素濃度的提高，促進效果越明顯。當寡糖素的濃度為40 mg·L-1時，蛇足石杉的干重增長率和石杉堿甲含量分別是對照組的1.3倍和1.5倍(圖7)。

圖7 寡糖素對蛇足石杉干重增長率(A)及石杉堿甲含量(B)的影響

4 討論

植物內源激素是植物體內天然存在的有機化合物，其含量低但卻對植物的生長發育起重要的調節作用，而外源激素是相對于內源激素而言的，其通過內源激素調節植物的生命活動[9]。本文通過添加外源激素6-BA與NAA和IBA進行組合，研究其對蛇足石杉組培苗生長和石杉堿甲積累的影響，發現6-BA與IBA組合較6-BA與NAA組合適合蛇足石杉組培苗的生長，而0.50 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1IBA為最適濃度。Waegel等研究發現激素NAA與6-BA組合對亮葉石杉Huperzialucidulum組培苗的生長具有促進作用但促進效果與對照組相比并不顯著[10]。

在植物的組織培養過程中，氮作為無機營養成分必不可少，且通常以硝態氮和銨態氮相互配合的形式存在。在多種植物的培養過程中發現，無機氮源的總量和NH4+/NO3-的比例均會對植物的生長產生不同程度的影響[11-12]。本研究發現15 mmol·L-1的無機氮源利于蛇足石杉的生長，NH4+：NO3-為1∶5利于石杉堿甲的積累，可能是硝態氮在硝酸還原酶和亞硝酸還原酶的作用下還原成NH4+和pH影響植物對硝態氮和銨態氮的吸收等原因導致了蛇足石杉對硝態氮的偏向性[13]。

在植物組織培養中添加前體物質是一種常用的通過增加底物供應或者作為催化代謝途徑中某關鍵酶來提高生物產量和目的次生代謝產物的方法[16]。本研究發現L-賴氨酸在實驗濃度范圍內對蛇足石杉中石杉堿甲的積累具有促進作用，其中0.5 mmol·L-1的賴氨酸為最適濃度，其石杉堿甲含量在培養12周時較對照組提高了71.46%，這也驗證了蛇足石杉可通過L-賴氨酸脫羧酶催化L-賴氨酸脫羧形成1，5-戊二胺進入石杉堿甲代謝途徑[14-15]。

誘導子從細胞培養的角度看，是指能夠促進細胞產生目的代謝產物的因子，而從植物病理學角度看是植物抗病過程產生誘發植物產生抗毒素和引起植物過敏反應的因子，根據其來源不同可分為非生物誘導子與生物誘導子[16]。一氧化氮是一種水溶性兼脂溶性可擴散的小分子物質，其影響著植物的呼吸，種子萌發，根葉生長等一系列生物生長發育過程，其作為有效的非生物誘導子被廣泛的應用到植物次生代謝產物的研究中[17]。本研究以硝普鈉(SNP)作為一氧化氮(NO)的供體，考察其對蛇足石杉生物量和石杉堿甲調控的影響，結果表明，10 μmol·L-1的SNP有利于蛇足石杉生物量的積累，并促進了石杉堿甲含量的提高，其可能是觸發蛇足石杉的防衛反應、調節了氮、碳代謝或者是激發了石杉堿甲次生代謝相關酶活性[18]。寡糖素是一種具有生物活性的寡糖，作為一種新型的生物誘導子被廣泛用來調控植物的生長發育和次生代謝產物積累。本研究發現在實驗濃度范圍內石斛寡糖素對蛇足石杉生物量和石杉堿甲的積累均有不同程度的促進作用，其中40 mg·L-1的濃度效果最顯著，這與諸多研究結果相符。甘煩遠等人的研究表明人參寡糖素可顯著提高云南紅豆杉細胞的增長率和代謝物次生紫杉醇的含量，也能提高紅花細胞的生長率及次生代謝物α-生育酚的含量[19-20]。一般認為寡糖素通過與細胞上的受體結合，從而導致細胞的生理變化，而對于其誘導次生代謝產物的形成的機理尚不清楚，有待進一步研究。

[1] 梁昊，潘利華，羅建平.石杉堿甲資源可持續利用研究進展[J].安徽農業科學，2010，38(23)：12467-12468.

[2] Ma X Q，Gang D R.In vitro production of huperzine A，a promising drug candidate for Alzheimer's disease[J].Phytochemistry，2008，69(10)：2022-2028.

[3] Wang B，Wang H，Zhao H W，et al.Efficacy and safety of natural acetylcholinesterase inhibitor huperzine A in the treatment of Alzheimer’s disease：an updated meta-analysis[J].J Neural Transm，2009，116(4)：457-465.

[4] Ha G T，Wong R K，Zhang Y.Huperzine a as potential treatment of Alzheimer’s disease：an assessment on chemistry，pharmacology，and clinical studies[J].Chem Biodivers，2011，8(7)：1189-1204

[5] 雷萬學.哈伯因片劑的穩定性試驗[J].臨床醫學，2002，22(5)：57-58.

[6] 江紅霞，李亞玲，葉建飛，等.雙益平對精神分裂癥患者認知功能影響的對照研究[J].山東精神醫學雜志，2006，19(4)：269-270.

[7] 楊雪飛，羅建平，王瑛.蛇足石杉莖尖滅菌方法與組織培養的研究[J].安徽農業科學，2008，36(12)：4947-4949.

[8] 周小雷，袁經權，王碩，等.HPLC 法測定不同季節千層塔中石杉堿甲和石杉堿乙含量[J].中華中醫藥雜志，2013，28(2)：504-506.

[9] 李代麗，康向陽.植物愈傷組織培養中內外源激素效應的研究現狀與展望[J].生物技術通訊，2007，18(3)：546-548.

[10] Dwyer T，Waegel A S.Effect of growth regulators onHuperzialucidulumexplants in vitro.Acta Hort，2004，631，181-185.

[11] Yan Q Y，Duan Z Q，Li J H，et al.Cucumber growth and nitrogen uptake as affected by solution temperature and NO3-：NH4+ratios during the seedling[J].Kor J Hort Sci Techno，2013，31(4)：393-399.

[12] Zhang F C，Kang S Z，Li F S，et al.Growth and major mutrient concentrations in brassica campestris supplied with differentNH4+/NO3-ratios[J].J Integr Plant Biol，2007，49(4)：455-462.

[13] 張樹清，魏小平.蔬菜作物對硝銨態氮吸收能力比較研究[J].蘭州大學學報(自然科學版)，2002，38(4)：77-84.

[14] Luo H M，Li Y，Sun C，et al.Comparison of 454-ESTs fromHuperziaserrataandPhlegmariuruscarinatus reveals putative genes involved in lycopodium alkaloid biosynthesis and developmental regulation.[J].BMC plant biology，2010，10(1)：209.

[15] Ma X Q，Gang D R.The Lycopodium alkaloids[J].Nat Prod Rep，2004，21(6)：752-772.

[16] 谷榮輝，洪利亞，龍春林.植物細胞培養生產次生代謝物的途徑[J].植物生理學通訊，2013，(9)：869-881.

[17] 張秀瑋，董元杰，邱現奎，等.外源NO對不同作物種子萌發、幼苗生長及抗氧化酶活性的影響[J].植物營養與肥料學報，2012，18(2)：397-404.

[18] 鄭春芳，姜東，戴廷波，等.外源一氧化氮供體硝普鈉浸種對鹽脅迫下小麥幼苗碳氮代謝及抗氧化系統的影響[J].生態學報，2010，30(5)：1174-1183.

[19] 甘煩遠，彭麗萍，鄭光植.云南紅豆杉細胞培養中紫杉醇的代謝調控[J].云南植物研究，1996，18(4)：451-453.

[20] 甘煩遠，鄭光植，王世林等.誘導子人參寡糖對紅花培養細胞的生理效應[J].Acta Botancia Sinica，1992，34(3)：208-213.

EffectsofDifferentConditionsontheGrowthofMicropropagatedHuperziaserrataPlantletsandtheAccumulationofHuperzineA

ZHANGXiaohong，LIXiaojun，YANGXuefei，LUOJianping*

(SchoolofBiotechnologyandFoodEngineering，HefeiUniversityofTechnology，Hefei230009，China)

Objective：The present study aims at investigating the effects of different conditions on the growth of micropropagatedHuperziaserrataplantlets and the accumulation of huperzine A.Methods：The basal mediums were supplemented with different concentrations of hormones，inorganic nitrogen sources，precursor Lys and elicitors.The increase in dry weight of micropropagatedH.serrataplantlets and the content of huperzine A were determined.Results：The micropropagated plantlets had different responses to the different factors not only in growth rate but also in huperzine A accumulation.Among these factors，the combination of 0.50 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1IBA was the optimum condition for the growth of micropropagatedH.serrataplantlets，which was 1.32-fold of the control after 12 weeks.For the accumulation of huperzine A，Lys at 0.5 mmol·L-1was the most effective factor.Under this condition，huperzine A content in micropropagated plantlets was 0.72-fold higher than that of the control at 12 weeks.Conclusion：This study realized the regulation of the growth and huperzine A accumulation of micropropagatedH.serrataplantlets，which would provide a theoretical basis for exploitation ofH.serratausing plant microprogation technique.

Huperziaserrata；hormone；inorganic nitrogen sources；precursor；elicitor；huperzine A

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.4.018

2015-06-03)

*

羅建平，教授，研究方向：中草藥與功能食品；E-mail：jianpingluo@hfut.edu.cn