黃芪多糖對胃癌前病變模型大鼠胃黏膜P53、P65、VEGF蛋白表達及AI的影響

徐靜雯，王　楠

（1.山東中醫藥大學第一臨床醫學院，濟南　250112；2.山東省腫瘤醫院外九科，濟南　250112）

黃芪多糖對胃癌前病變模型大鼠胃黏膜P53、P65、VEGF蛋白表達及AI的影響

徐靜雯1＊，王楠2

（1.山東中醫藥大學第一臨床醫學院，濟南250112；2.山東省腫瘤醫院外九科，濟南250112）

目的：探討黃芪多糖對胃癌前病變（PLGC）模型大鼠胃黏膜P53、P65、血管內皮生長因子（VEGF）蛋白及細胞凋亡指數（AI）的影響。方法：將60只大鼠隨機分為正常對照組、模型對照組、維酶素片組（陽性藥物，0.01 g/kg）和黃芪多糖低、高劑量組（0.5、1.0 g/kg），除正常對照組外，其余各組復制PLGC模型。建模成功后，各給藥組大鼠ig相應藥物，正常對照組和模型對照組大鼠ig生理鹽水，每天1次，連續8周。檢測各組大鼠胃黏膜P53、P65、VEGF蛋白的表達及AI，并觀察胃黏膜病理變化。結果：與正常對照組比較，模型對照組及各給藥組大鼠胃黏膜P53、P65、VEGF蛋白表達增強（P＜0.05），AI降低；胃黏膜有變薄、欠光滑、黏液減少等PLGC現象。與模型對照組比較，各給藥組大鼠胃黏膜P53、P65、VEGF蛋白表達減弱、AI升高，且黃芪多糖低、高劑量組上述指標變化較維酶素片組更為明顯（P＜0.05）；胃黏膜病理情況得到改善。與黃芪多糖低劑量組比較，黃芪多糖高劑量組大鼠胃黏膜P53、P65、VEGF蛋白表達減弱、AI升高更為明顯（P＜0.05）。結論：黃芪多糖可下調PLGC模型大鼠P53、P65、VEGF蛋白表達，降低AI，從而控制PLGC進展。

黃芪多糖；胃癌前病變；細胞凋亡；基因突變；大鼠

胃癌為消化道常見惡性腫瘤，其病死率居惡性腫瘤第2位［1］。以往研究認為，胃癌的發生與胃黏膜上皮細胞無限增殖所引起的細胞集聚、原癌基因激活及抑癌基因活性喪失有關［2］。據近年研究報道，胃癌患者不僅伴胃黏膜上皮細胞異常增生，同時伴生存素、核轉錄因子等凋亡抑制因子失衡等現象［3］。慢性萎縮性胃炎（CAG）、胃癌前病變（PLGC）患者為胃癌高危人群。CAG與長期吸煙、飲酒和幽門螺桿菌感染有關，患者胃黏膜多伴炎性細胞浸潤，有腸化生、異常增生的表現［4］；PLGC在CAG基礎上伴不完全腸上皮化及中、重度異型增生。目前，對PLGC多采用維酶素片治療，可改善患者胃部黏膜病變、減輕炎癥、預防胃癌、抑制癌細胞表達，但長期服用有一定副作用，安全性欠佳［5］。據文獻報道，中醫藥對PLGC有較好的治療效果，以益氣活血法為主，其在胃癌及PLGC中應用較為廣泛，且療效肯定。黃芪為常用益氣藥，其有效成分為黃芪多糖，目前已被證實具有高效抗病毒、抗炎癥、抗氧化、抗腫瘤作用，在PLGC免疫系統調控、促進抗癌細胞素分泌中有積極作用［6］。本研究擬以PLGC大鼠為模型動物，以維酶素片為陽性藥物，考察黃芪多糖對PLGC模型大鼠P53、P65、血管內皮生長因子（VEGF）蛋白以及細胞凋亡指數（AI）的影響，旨在將黃芪多糖研發為多靶點、多環節的新型抗腫瘤藥物提供實驗依據。

1　材料

1.1儀器

BX-51光學顯微鏡、DP-70圖像采集系統（日本Olympus公司）；Ventana-ES全自動免疫組化儀（美國Ventana公司）；高速冷凍離心機（長沙湘智離心機儀器有限公司）。

1.2藥品與試劑

黃芪多糖（南京澤郎醫藥科技有限公司，批號：ZL110421，純度：＞80%）；維酶素片（四川大冢制藥有限公司，批號：20110601，規格：0.2 g/片）；甲基硝基亞硝基胍（MNNG，東京仁成工業株式會社制造）；兔抗人P53、P65單克隆抗體、SABC免疫組化試劑盒（批號：NRPB32）均購自武漢博士德微生物有限責任公司；脫氧核糖核酸末端轉移酶介導dUTP缺口末端標記（TUNEL）細胞凋亡檢測試劑盒（南京凱基生物科技有限公司，批號：090606）；VEGF免疫組化檢測試劑盒（上海明豐生物科技有限公司，批號：100663）；其余試劑均為國產分析純。

1.3動物

健康SD大鼠60只，♂，體質量140～170 g，由山東大學動物實驗中心提供［合格證號：SCXK（魯）2003-0004］。室內溫度為（22±2）℃，光照適宜，濕度為55%～65%，通風良好，大鼠分籠飼養，喂全價營養顆粒飼料，自由飲水。

2　方法

2.1動物分組、造模與給藥

將大鼠隨機分為5組，即正常對照組、模型對照組、維酶素片組（0.01 g/kg，人臨床用量的等效劑量）與黃芪多糖低、高劑量組（0.5、1.0 g/kg，人臨床用量的0.5、2倍劑量），每組12只。除正常對照組外，其余各組大鼠均采用MNNG法［7］復制PLGC模型。造模大鼠每天自由飲用150 μg/ml MNNG溶液，配以饑飽失常處理（雙日飽食、單日禁食），持續12周；正常對照組大鼠自由飲水，并配以相同的饑飽失常處理。12周末，每組選2只大鼠，以10%水合氯醛（0.3 ml/100 g）麻醉，暴露游離胃部，取胃體、胃竇標本，光鏡下觀察，若胃黏膜出現上皮非典型增生、腸上皮化生則視為造模成功。造模成功后，各給藥組大鼠ig相應藥液，正常對照組和模型對照組ig生理鹽水（20 ml/kg），每天1次，連續8周。期間各組大鼠均自由攝食飲水。

2.2取材及指標檢測

末次給藥0.5 h后，10%水合氯醛麻醉大鼠，取腹主動脈血，分離血清，然后脫頸椎處死大鼠，取完整胃組織。10%多聚甲醛固定24 h，常規石蠟包埋，切片，采用蘇木精-伊紅（HE）染色，觀察大鼠胃黏膜病理變化。并采用免疫組化法檢測胃黏膜P53、P65、VEGF蛋白的表達；采用TUNEL法檢測胃黏膜AI，實驗操作均按照相應試劑盒說明書進行。

2.3統計學方法

3　結果

3.1各組大鼠胃黏膜病理觀察結果

正常對照組大鼠胃黏膜表面光滑、皺襞完整，上皮細胞呈單層柱狀，排列整齊、規律，無脫落、缺損，胃底腺形態規則，主細胞、黏液細胞、壁細胞分布正常，黏膜肌層可見少量環層排列平滑肌纖維；模型對照組大鼠胃黏膜變薄、欠光滑、黏液減少，呈暗紅色或紅白相間，部分可見陳舊性出血點，伴環狀或點狀糜爛，黏膜皺襞低平、走向紊亂，黏膜下層血管暴露，上皮細胞不完整，可見上皮細胞壞死、脫落，伴漿細胞、淋巴細胞浸潤，伴散在單核、中性粒細胞及嗜酸細胞，胃底腺減少，結構非規則，且排列紊亂；維酶素片組大鼠胃黏膜病變有所改善，黏膜肌層稍有增厚，間質可見炎性細胞浸潤，部分黏膜腺體結構不規則，伴少部分腺體擴張，可見壁細胞空泡樣變性；黃芪多糖低劑量組大鼠胃黏膜上皮結構稍不規則，細胞排列較整齊，腺體擴張減輕，壞死黏膜減少，黏膜層及固有層炎性細胞浸潤減少；黃芪多糖高劑量組大鼠胃黏膜細胞上皮結構趨向規則，細胞排列相對整齊，壞死黏膜減少或消失，腺體形態改善，未見明顯壞死，固有層、黏膜層炎性細胞浸潤明顯減少。各組大鼠胃黏膜病理圖片見圖1。

圖1　各組大鼠胃黏膜病理圖片（HE，×40）Fig 1　The pathological pictures of gastric mucosa of rats in each group（HE，×40）

3.2各組大鼠胃黏膜P53、P65蛋白表達測定結果

與正常對照組比較，模型對照組及各給藥組大鼠胃黏膜P53、P65蛋白表達增加（P＜0.05）；與模型對照組比較，各給藥組大組胃黏膜P53、P65蛋白表達減少（P＜0.05）；與維酶素片組比較，黃芪多糖低、高劑量組大鼠胃黏膜P53、P65蛋白表達減少（P＜0.05）；與黃芪多糖低劑量組比較，黃芪多糖高劑量組大鼠胃黏膜P53、P65蛋白表達減少（P＜0.05）。各組大鼠胃黏膜P53、P65蛋白表達測定結果見表1。

表1　各組大鼠胃黏膜P53、P65蛋白表達測定結果（±s，n=10）Tab 1　The protein expression of P53 and P65 in gastric mucosa of rats in each group（±s，n=10）

表1　各組大鼠胃黏膜P53、P65蛋白表達測定結果（±s，n=10）Tab 1　The protein expression of P53 and P65 in gastric mucosa of rats in each group（±s，n=10）

注：與正常對照組比較，＊P＜0.05；與模型對照組比較，#P＜0.05；與維酶素片組比較，ΔP＜0.05；與黃芪多糖低劑量組比較，&P＜0.05Note：vs.normal control group，＊P＜0.05；vs.model control group，#P＜0.05；vs.vitacoenzyme tablet group，ΔP＜0.05；vs.astragalus polysaccharide low-dose group，&P＜0.05

P65 2.47±1.62 56.94±27.43＊33.75±17.72＊#20.81±5.34＊#Δ12.84±6.84＊#Δ&組別正常對照組模型對照組維酶素片組黃芪多糖低劑量組黃芪多糖高劑量組劑量，g/kg 0.01 0.5 1.0 P53 11.21±1.56 28.22±2.16＊17.46±1.32＊#15.87±1.46＊#Δ12.95±1.85＊#Δ&

3.3各組大鼠胃黏膜AI與VEGF蛋白表達測定結果

與正常對照組比較，模型對照組及各給藥組大鼠胃黏膜AI降低、VEGF蛋白表達增加（P＜0.05）；與模型對照組比較，各給藥組大鼠胃黏膜AI升高、VEGF蛋白表達減少（P＜0.05）；與維酶素片組比較，黃芪多糖高、低劑量組大鼠胃黏膜AI升高、VEGF蛋白表達減少（P＜0.05）；與黃芪多糖低劑量組比較，黃芪多糖高劑量組大鼠胃黏膜AI升高、VEGF蛋白表達減少（P＜0.05）。各組大鼠胃黏膜AI與VEGF蛋白表達測定結果見表2。

表2　各組大鼠胃黏膜AI與VEGF蛋白表達測定結果（±s，n=10）Tab 2　The AI and protein expression of VEGF in gastric mucosa of rats in each group（±s，n=10）

表2　各組大鼠胃黏膜AI與VEGF蛋白表達測定結果（±s，n=10）Tab 2　The AI and protein expression of VEGF in gastric mucosa of rats in each group（±s，n=10）

注：與正常對照組比較，＊P＜0.05；與模型對照組比較，#P＜0.05；與維酶素片組比較，ΔP＜0.05；與黃芪多糖低劑量組比較，&P＜0.05Note：vs.normal control group，＊P＜0.05；vs.model control group，#P＜0.05；vs.vitacoenzyme tablet group，ΔP＜0.05；vs.astragalus polysaccharide low-dose group，&P＜0.05

VEGF 176.23±28.91#265.25±38.26＊238.66±24.11＊#210.42±21.23＊#Δ184.12±22.72＊#Δ&組別正常對照組模型對照組維酶素片組黃芪多糖低劑量組黃芪多糖高劑量組劑量，g/kg 0.01 0.5 1.0 AI，% 10.56±2.31#3.32±2.64＊5.68±0.52＊#7.53±0.32＊#Δ9.89±0.36＊#Δ&

4　討論

現代醫學研究證實，黃芪富含多糖、皂苷、氨基酸、葉酸等多類微量元素，可強化機體免疫抵抗力、利尿、保肝，且抗應激、抗衰老、抗氧化、抗菌作用顯著，黃芪多糖為其主要活性成分［8］。黃芪多糖有較強的抗腫瘤作用，可增強B淋巴細胞、自然殺傷（NK）細胞、巨噬細胞活性，促進免疫因子釋放，強化機體免疫功能，抵抗外界不良因子的入侵［9］。此外其還可通過調節神經-內分泌-免疫系統發揮作用，對誘導干擾素有其積極作用，可促進細胞凋亡、抑制腫瘤細胞增殖。

PLGC指發生于癌變前的胃黏膜病理學改變，是正常胃黏膜向胃癌轉變的過程，誘導PLGC細胞凋亡是防治胃癌的重要途徑。Liding C等［10］研究顯示，在胃癌形成過程中，原癌基因被激活、抑癌基因活性喪失是促進腫瘤生長的原因。P53為抗癌基因，其介導的細胞信號轉導在調節細胞正常生命活動中發揮著重要作用，P53基因功能失調或突變可導致腫瘤惡性增生、加速癌變。Bathaie SZ等［11］研究顯示，約有50%腫瘤組織中P53基因發生突變，為腫瘤常見的遺傳學改變。本研究結果顯示，維酶素片組和黃芪多糖低、高劑量組大鼠胃黏膜組織中P53蛋白表達均明顯下調。

P65蛋白是核因子κB（NF-κB）蛋白因子重要組成部分，正常情況下，NF-κB蛋白與其相關抑制蛋白（IKB）結合為復合體，穩定存在于細胞質內。當受到外界因素刺激時，IKB被磷酸化，在蛋白水解酶作用下降解，從而激活NF-κB蛋白進入細胞核，與DNA模塊特異性蛋白結合，促進P53核移位并聚集于細胞核內，導致NF-κB蛋白異常激活、促進轉錄、影響正常信號通路轉導、促進癌變、提高抑凋亡蛋白表達、抑制癌細胞凋亡、加速癌癥進展。Manikandan P等［12］研究發現，P65在胃癌患者胃黏膜組織上皮細胞漿及細胞核內表達水平較正常人群高，故認為NF-κB蛋白異常激活與胃癌的發生及進展存在密切聯系，可將P65蛋白水平作為評估胃癌良/惡性的有效標志。本實驗結果顯示，模型對照組大鼠胃黏膜P65蛋白表達較正常對照組明顯升高，表明PLGC大鼠存在NF-κB蛋白異常激活現象；在給予藥物干預后，給藥組大鼠胃黏膜P65蛋白水平均明顯降低，表明NF-κB蛋白異常激活現象得到改善。

VEGF為反映腫瘤細胞生長的相關指標，其過度表達可誘導腫瘤細胞和血管內皮細胞增殖，增加血管通透性，促進細胞分裂、增生、轉化，參與腫瘤的進展、浸潤及轉移，其高表達與腫瘤進展有關。且在癌病及腫瘤形成的早期過程中，常伴大部分癌細胞凋亡表現，與癌前病變機體為平衡癌細胞增殖所產生的調節機制有關。細胞凋亡組基因快速、規律降解，以預防腫瘤發生及進展，但在腫瘤形成后，抗凋亡基因失活，導致癌細胞聚集速率增加，腫瘤生長速度加快，影響組織分化、發育及自身穩定，更易出現惡性病變。Nakamura M等［13］研究顯示，在胃黏膜癌變過程中，可能存在細胞選擇性增殖現象，其中部分細胞保留且增殖，部分細胞則因凋亡而被淘汰。其中具備高增殖能力的細胞可形成穩定高增殖性群體，降低AI、加快細胞集聚速率、促進腫瘤生長。本研究中，模型對照組AI低于其他各組，表明腫瘤生長速度加快；但采用藥物干預后，AI升高，表明增殖細胞群體減少、癌變進程延緩。

綜上，黃芪多糖可下調PLGC大鼠P53、P65、VEGF蛋白表達，升高AI，減輕PLGC大鼠胃黏膜損傷，對控制PLGC進展有積極的作用。

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［10］ Liding C，Xuee W，Xiao DC，et al.Comparison between the digestive behaviors of a new in vitro rat soft stomach model with that of the in vivo experimentation on living rats：motility and morphological influences［J］.J Food Eng，2013，117（2）：183.

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（編輯：林靜）

Effects of Astragalus Polysaccharides on the Protein Expression of P53，P65，VEGF and AI in Gastric Mucosa of Rats with Precancerous Lesions of Gastric Cancer

XU Jingwen1，WANG Nan2
（1.The First Clinical Medical College of Shandong University of TCM，Jinan 250112，China；2.Surgical Ward 9，Shandong Cancer Hospital，Jinan 250112，China）

OBJECTIVE：To investigate the effects of astragalus polysaccharides on the protein expression of P53，P65 and vascular endothelial growth factor（VEGF）and apoptosis index（AI）in rats with precancerous lesions of gastric cancer（PLGC）. METHODS：60 rats were randomly divided into normal control group，model control group，Vitacoenzyme tablet group（positive drug，0.01 g/kg），astragalus polysaccharide low-dose and high-dose groups（0.5，1.0 g/kg）.Except for normal control group，PLGC model was induced in those groups.After modeling，those groups were given relevant medicine intragastrically，and normal control group and model control group were given normal saline intragastrically，once a day，for 8 weeks.The protein expression of P53，P65，VEGF in gastric mucosa and AI of rats were determined，and the pathological changes of gastric mucosa was observed.RESULTS：Compared with normal control group，the protein expression of P53，P65，VEGF in gastric mucosa increased in model control group and treatment groups（P＜0.05），while AI decreased；gastric mucosal lesions occurred like thin，less smooth，less mucus and other precancerous lesions.Compared with model control group，protein expression of P53，P65，VEGF in gastric mucosa decreased in treatment groups，while AI increased；the changes of above indexes in astragalus polysaccharide low-dose and high-dose groups were more significant than in Vitacoenzyme tablet group（P＜0.05）；the pathological changes were improved.Compared with astragalus polysaccharide low-dose group，the protein expression of P53，P65，VEGF in gastric mucosa decreased in high-dose group，while AI increased significantly（P＜0.05）.CONCLUSIONS：Astragalus polysaccharide can downregulate the protein expression of P53，P65，VEGF in PLGC model rats and down-regulate AI so as to control the progress of PLGC.

Astragalus polysaccharide；Precancerous lesions of gastric cancer；Apoptosis；Gene mutation；Rats

R285

A

1001-0408（2016）22-3069-03

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.22.14

＊中醫師，博士研究生。研究方向：中醫內科學。E-mail：773808510@qq.com

2016-03-09

2016-06-01）