蓖麻矮化相關基因RcDof的克隆及分析

孫華軍,李國瑞,2,3,4,黃鳳蘭,2,3,4,李　躍,叢安琪,李　威,齊　蒙,陳永勝,2,3,4

(1.內蒙古民族大學 生命科學學院,內蒙古 通遼　028000;2.內蒙古自治區高校蓖麻產業工程技術研究中心,內蒙古 通遼　028000;3.內蒙古自治區蓖麻育種重點實驗室,內蒙古 通遼　028000;4.內蒙古自治區蓖麻產業協同創新培育中心，內蒙古 通遼　028000;5.內蒙古民族大學 農學院,內蒙古 通遼　028000)

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蓖麻矮化相關基因RcDof的克隆及分析

孫華軍1,李國瑞1,2,3,4,黃鳳蘭1,2,3,4,李躍1,叢安琪1,李威5,齊蒙5,陳永勝1,2,3,4

(1.內蒙古民族大學 生命科學學院,內蒙古 通遼028000;2.內蒙古自治區高校蓖麻產業工程技術研究中心,內蒙古 通遼028000;3.內蒙古自治區蓖麻育種重點實驗室,內蒙古 通遼028000;4.內蒙古自治區蓖麻產業協同創新培育中心，內蒙古 通遼028000;5.內蒙古民族大學 農學院,內蒙古 通遼028000)

為研究RcDof基因在蓖麻矮化中的作用及生物學功能,提取蓖麻生長躍變期莖尖中基因組DNA,根據蓖麻中已獲得的鋅指蛋白基因片段設計引物,采用RACE技術克隆得到該基因,基因完整閱讀框全長為924 bp,可編碼307個氨基酸,為C2C2型鋅指蛋白,預測蛋白質分子量為34.020 9 kDa,等電點為9.23。二級結構預測表明α螺旋占1.63%,β折疊占1.30%,其他無規則卷曲占97.07%,為外釋放蛋白。亞細胞定位于細胞核中,對RcDof基因的生物信息學分析為進一步研究其在蓖麻矮化過程中的作用機制和功能特征提供理論依據。

蓖麻矮化;基因克隆;亞細胞定位;生物信息學分析

蓖麻(RicinuscommunisL.)為大戟科蓖麻屬植物,是特種油料作物[1]。蓖麻油及其衍生物廣泛應用于工業、國防、農業、醫藥等領域,具有較高的經濟價值。由于目前蓖麻產量不高,與其他經濟作物如玉米、水稻等相比種植效益低下,使得農民的種植積極性受到制約,從而極大地限制了蓖麻種植業的發展。而矮稈蓖麻植株矮,增強了其抗倒伏、抗旱性及耐瘠薄能力,使蓖麻防災抗災能力明顯增強,提高了瘠薄地或邊際地的利用效率,提高蓖麻產量,進而調動了農民種植的積極性[2]。因此，培育抵抗能力強、適合機械化栽培、產量高的蓖麻矮化新品種為蓖麻育種的首要目標[3],也是實現農民增收、提高國民利益的有效途徑。

Dof(DNA-binding with one finger)蛋白是植物特有的一類轉錄因子[4],在植物生長發育過程中起著重要的作用。Dof 蛋白一般由200～400 個氨基酸組成。通常包含2 個主要的結構域:位于N-末端的DNA 高度保守結合域[5]和位于C-末端的轉錄調控域[6]。Dof蛋白N-末端的DNA結合域是由52個保守的氨基酸殘基組成的C2C2型單鋅指結構域,此單鋅指結構中有4個絕對保守的Cys殘基和1個Zn2+共價結合。Zn2+和Cys殘基是Dof蛋白保持活性所必需的,二價離子鰲合劑的存在以及對Cys殘基的任何替換都會使Dof蛋白喪失活性[7]。位于Dof 蛋白C-末端的轉錄調控結構域,其氨基酸序列較為多變不具有保守性[8]。

研究表明:Dof蛋白在植物生長發育過程中參與多種生物學過程,如碳氮代謝、光響應、花和花粉發育、種子發育和萌發、次生代謝、保衛細胞特異基因的調控、植物生長素響應等,可以調控植株矮化、花粉敗育等表型變化[9-15]。本試驗擬通過克隆與蓖麻矮化相關的RcDof基因并進行生物信息學分析,為進一步研究RcDof基因對蓖麻矮化的調控機制奠定理論依據。

1　材料和方法

1.1試驗材料

蓖麻通蓖5號及其子代矮化品種由內蒙古通遼市農業科學研究院提供。

1.2試驗方法

1.2.1總RNA的提取采用TaKaRa的RNA提取試劑盒提取蓖麻通蓖5號生長躍變期莖尖的總RNA,備用。

1.2.2RcDof基因5′RACE和3′RACE的擴增以蓖麻通蓖5號生長躍變期莖尖的總RNA為模板,參照TaKaRa公司的cDNA逆轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄,分別合成5′RACE和3′RACE cDNA第一鏈。根據蓖麻中已獲得的鋅指蛋白基因片段設計3′端引物序列為AATTCTGTTGCAACACTG,5′端引物序列為GAAACAAAAGCAAAACC。2條引物間重疊序列為107 bp,擴增出的3′端序列和5′端序列送GENERAY公司測序。

1.2.3RACE擴增片段的克隆5′RACE和3′RACE的PCR擴增產物大小用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定,然后用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收特異條帶,連接pMD-18T載體,轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞,進行藍白斑篩選,挑取白色單菌落,放大培養后用5′RACE和3′RACE引物進行PCR擴增,擴增程序:94 ℃預變性 5 min,94 ℃ 變性30 s,51.4 ℃退火30 s,72 ℃ 延伸30 s,28個循環。將陽性克隆送至GENERAY公司測序。

1.2.4RcDof基因的生物信息學分析克隆得到的RcDof基因序列,利用ExPASy ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)預測蛋白質的分子式、分子量、等電點和不穩定系數等。利用Predict-protein(http://www.predictprotein.org)對蛋白質二級結構進行預測,利用TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)對蛋白質跨膜型進行預測,利用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/smart/job)對蛋白質結構域進行預測。

1.2.5亞細胞定位分析用限制性內切酶NocⅠ和SpeⅠ對表達載體pCAMBIA1302線性化,將RcDof基因與線性化的表達載體pCAMBIA1302連接,得到連接產物為pCAMBIA1302-RcDof,并將連接產物pCAMBIA1302-RcDof轉化到大腸桿菌感受態DH5α中,對重組子進行PCR擴增檢測和酶切檢測。將連有RcDof基因的表達載體pCAMBIA1302-RcDof轉入到農桿菌感受態EHA105中,并對重組子進行PCR擴增檢測和酶切檢測。參照連肖華等[16]利用農桿菌介導法轉化洋蔥表皮細胞進行定位,并在熒光顯微鏡下進行觀察。

2　結果與分析

2.1蓖麻總RNA的提取

通過圖1可以看出,利用RNA提取試劑盒法提取蓖麻生長躍變期莖尖的總RNA,經電泳檢測后沒有DNA污染,28S和18S核糖體RNA亮度接近2∶1,紫外分光光度計檢測結果顯示OD260/280為1.90,說明提取的蓖麻莖尖總RNA純度高,可用于后續試驗。

圖1　蓖麻總RNA提取結果

2.2RcDof基因及編碼的氨基酸特征分析

在已知序列的基礎上利用RACE試劑盒對鋅指蛋白RcDof基因進行5′RACE PCR擴增和3′RACE PCR擴增,產物大小分別為485,513 bp(圖2)。測序后對序列進行拼接獲得具有完整開放閱讀框(Open reading frame,ORF) 全長為924 bp的序列,編碼307個氨基酸,其中絲氨酸含量最高達到41個,占13.4%;蘇氨酸30個,占9.8%;谷氨酰胺和天冬酰胺27個,占8.8%。根據ExPASy ProtParam 預測:RcDof基因編碼蛋白的分子式為C1465H2325N425O480S14,分子量為34.020 9 kDa,推測的等電點為9.23,不穩定系數為51.54(>40),屬于不穩定蛋白。RcDof肽鏈中帶負電荷殘基總數20,帶正電荷殘基總數30,半衰期為30 h。根據ProtScale 預測和分析RcDof蛋白氨基酸序列疏水性平均值為-0.727,表現出疏水性,由此推斷該蛋白可能為疏水蛋白。Predict-protein分析發現α螺旋占1.63%,β折疊占1.30%,其他無規則卷曲占97.07%。

2.3RcDof同源性和系統進化分析

利用ClustalW 軟件將RcDof的氨基酸序列與其他已知植物的氨基酸序列進行多序列比對(圖3),結果表明,RcDof與已知植物的Dof家族蛋白高度同源,與毛果楊氨基酸序列同源性達90%。利用MEGA 5.2 軟件構建系統進化樹(圖4),結果表明,RcDof先與毛果楊PtDof形成分支,結果符合進化關系,與同源性比對結果一致。

M.DL2000 Marker;1.5′RACE擴增產物;2.3′RACE擴增產物。

圖3　多個蛋白同源性比較

圖4　進化樹分析

2.4RcDof功能預測

Iprscan分析后發現在RcDof氨基酸序列中有3個Dof型鋅指蛋白結構域,分別位于44～101的zf-Dof-1,55～86的zf-Dof和48～102的zf-Dof-2氨基酸(圖5)。進一步證實該基因具有鋅指結構,并極有可能為鋅指蛋白。

圖5　三個鋅指結構區

SMART軟件進一步分析后發現48～84位氨基酸有ZnF_C2C2鋅指結構,功能為轉錄延伸因子TFIIS和RNA聚合酶的結合序列。46～81位氨基酸有一個ZnF_RBZ鋅指結構,(Ran是細胞內的一種具有GTP酶活性的功能蛋白,可以調節染色體穩定性、細胞核組建以及核質運輸等多種細胞進程[17])其主要功能是鋅指中的Ran-binding蛋白質結合域,還有其他蛋白,該區域能夠結合RanGDP。47～81位氨基酸有ZnF_C4鋅指結構,是一種激素的受體,功能為C4鋅指核激素受體,可以與激素相互作用而發揮相應的生物學功能。70～105位氨基酸有Znf_U1鋅指蛋白(表1)。該分析結果表明該序列含有很多鋅指結構,屬于Dof鋅指蛋白,并且極有可能具有以上的功能。

表1　SMART軟件分析結果

2.5亞細胞定位

利用農桿菌介導法進行洋蔥表皮細胞定位發現RcDof蛋白定位于細胞核中,表明該基因在細胞核中表達(圖6)。

A.定位結果;B.陽性對照;C.陰性對照。

3　討論

Dof蛋白是植物特有的一類轉錄因子,在動物和酵母中并不存在。Dof蛋白在植物生長發育過程中起著重要作用,包括調控模式植物擬南芥的開花和光敏色素信號的轉導[17],擬南芥中Dof6轉錄因子可以通過調控ABA的合成影響種子的萌發[18],擬南芥AtDof4.2基因可以導致花粉敗育[19],煙草Dof蛋白NtBBF1能調控生長素的誘導表達[20],大豆中Dof轉錄因子GmDof4和GmDof11可以通過調控脂肪酸生物合成過程中的相關基因,提高種子中油脂含量[21]。上述的報道表明,Dof轉錄因子參與植物生長發育的多個生物學過程。

本試驗克隆得到的Dof型鋅指蛋白RcDof基因是蓖麻中第1個報道的鋅指蛋白基因。結合C2C2鋅指蛋白的結構及功能預測,以及參照其在擬南芥和水稻中的功能,該C2C2型鋅指蛋白可能參與蓖麻的生長、發育及代謝等過程,對該鋅指蛋白基因的表達分析及其功能研究將是下一步探討的主要內容。同時亞細胞定位分析也表明該基因定位于細胞核中,本研究可為Dof轉錄因子在蓖麻植物中的調控作用奠定基礎理論,為培育蓖麻新品種提供思路和方法。

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Cloning and Analysis of RcDof Gene Associated with Castor Dwarfing

SUN Huajun1,LI Guorui1,2,3,4,HUANG Fenglan1,2,3,4,LI Yue1,CONG Anqi1,LI Wei5,QI Meng5,CHEN Yongsheng1,2,3,4

(1.College of Life Science,Inner Mongolia University for Nationalities,Tongliao028000,China;2.Inner Mongolia Industrial Engineering Research Center of Universities for Castor,Tongliao028000,China;3.Inner Mongolia Key Laboratory of Castor Breeding,Tongliao028000,China;4.Inner Mongolia Collaborate Innovation Cultivate Center for Castor,Tongliao02800,China;5.College of Agronomy,Inner Mongolia University for Nationalities,Tongliao028000,China)

In order to research the features and biological function ofRcDofgene in dwarf castor,stem tip genome DNA was extracted in growth climacteric age.Primers were designed according to obtained Zinc finger protein gene fragment.Using RACE technology,the complete full-length open reading frame of 924 bp was cloned,encoding 307 amino acids,belonged to C2C2 zinc finger protein,predicted protein molecular weight was 34.020 9 kDa,isoelectric point was 9.23.The predicted secondary structure α helix accounted for 1.63%,β fold accounted for 1.30%,other non-random coil accounted 97.07%,belonged to outer release proteins.Subcellular localization showed that theRcDofgene located in the nucleus.The bioinformatics analysis ofRcDofgene will lay the foundations for the further study on its action mechanism and function characteristics in the castor dwarfing process.

Castor dwarfing;Gene clone;Subcellular localization;Bioinformatics analysis

2016-03-21

國家自然科學基金項目(31460353);2015年全區研究生科研創新資助項目(S20151013601);內蒙古民族大學市校合作項目(SXZD2012006;SXZD2012017);內蒙古自治區科技創新引導資金項目(KJCX15002);內蒙古自治區蓖麻產業協同創新培育中心項目；內蒙古自治區蓖麻育種重點實驗室開放基金項目(MDK2016030)

孫華軍(1992-),女,內蒙古呼倫貝爾人,在讀碩士,主要從事蓖麻分子育種研究。

陳永勝(1971-),男,內蒙古通遼人,教授,博士,主要從事蓖麻分子育種研究。

Q78

A

1000-7091(2016)04-0063-05

10.7668/hbnxb.2016.04.011