腺嘌呤、鳥嘌呤致高尿酸血癥大鼠肝臟損害的研究*

宋燕郡于維森殷凡宋揚

腺嘌呤、鳥嘌呤致高尿酸血癥大鼠肝臟損害的研究*

宋燕郡①于維森②殷凡②宋揚①

目的：觀察腺嘌呤、鳥嘌呤作用高尿酸血癥大鼠肝臟時，肝臟功能變化情況及透射電鏡下肝臟超微結構的變化。方法：選用實驗用雄性Wistar大鼠36只，隨機分為A組（對照組）、B組（造模對照組）、C組（腺嘌呤組）、D組（腺嘌呤淀粉糊組）、E組（腺嘌呤、鳥嘌呤組）、F組（鳥嘌呤組），每組6只。B、C、D、E、F組連續給予酵母浸膏溶液15 g/（kg·d）灌胃7 d，誘導高尿酸血癥代謝模型。造模成功后，B組給予淀粉糊灌胃，C組給予20 mg/（kg·d）腺嘌呤淀粉糊混合液灌胃，D組給予10 mg/（kg·d）腺嘌呤淀粉糊混合液灌胃，E組10 mg/（kg·d）腺嘌呤混合10 mg/（kg·d）鳥嘌呤淀粉懸液灌胃，F組給予20 mg/（kg·d）鳥嘌呤淀粉糊混合液灌胃。持續14 d后，測定各組大鼠血清ALT、AST、UA，并作肝臟組織電鏡切片觀察肝臟損傷情況。結果：（1）電鏡下觀察C組溶酶體明顯增多，分散在細胞核周圍，并有深色顆粒物質。D組溶酶體數量略有增多，脂滴增多，開始進入溶酶體。E組溶酶體增多，脂滴增多，出現深色顆粒狀物質。F組膽小管中有少量深色顆粒狀物質。（2）C～F組大鼠谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶水平與B組比較差異均有統計學意義（P<0.05）；C～E組血尿酸值與B組比較差異均有統計學意義（P<0.05）。C、D、E組大鼠的谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、血尿酸水平均高于F組。結論：腺嘌呤、鳥嘌呤對高尿酸血癥大鼠的肝臟均有損害，腺嘌呤損害作用較大。腺嘌呤致使大鼠谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶水平顯著升高，其作用高于同等劑量的鳥嘌呤。腺嘌呤對大鼠血尿酸水平有明顯作用。

腺嘌呤； 高尿酸血癥； 鳥嘌呤； 肝臟損害； 超微結構

First-author’s address：Qingdao University Medical College Public Health School，Qingdao 266021，China

高尿酸血癥是痛風的發病前兆，它指的是血液中尿酸濃度高出正常范圍的一種機體狀態[1]。痛風及高尿酸血癥好發于男性中老年人群，其患病率與年齡增長呈逐正相關[2-4]。伴隨生活水平的提高及居民飲食結構的變化，亞洲地區無癥狀高尿酸血癥及痛風的發病率逐漸升高，并呈現年輕化趨勢[3，5]。其產生的兩大主要原因是，尿酸排泄減少以及嘌呤代謝障礙[6]。目前研究多認為，高尿酸血癥的發生，多是由于體內細胞的DNA 分解代謝、產生的嘌呤代謝障礙[7-9]。腺嘌呤、鳥嘌呤是構成人類及大鼠DNA的主要嘌呤。本實驗通過研究腺嘌呤、鳥嘌呤的不同組合對大鼠肝臟功能及肝臟超微結構產生的影響，初步探究兩者對肝臟的損傷程度差異及兩者間有無相互作用。

1　材料與方法

1.1實驗動物 健康雄性Wistar大鼠36只（青島市實驗動物和動物實驗中心提供），體質量（230±20）g。

1.2主要儀器與試劑 OLMPUS AU2700Beckman全自動生化分析儀（日本OLMPUS公司），JEM-1200EX透射電鏡（日本JEOL公司）。腺嘌呤V900471-25G（美國Sigma公司），鳥嘌呤V900473-25G（美國Sigma公司），酵母浸膏（北京雙旋微生物培養基制品廠，批號20140320）。ALT、AST、UA試劑盒（上海科華診斷用品有限公司）。

1.3方法

1.3.1實驗分組及動物模型制備 雄性Wistar大鼠36只，按體重隨機分為六組，每組6只。環境溫度保持在15～24 ℃，相對濕度45%～55%，晝夜各12 h。實驗動物給予普通大鼠顆粒飼料，自由取食。A組為空白對照組。B、C、D、E、F組每天給予酵母浸膏15 g/（kg·d）灌胃，持續7 d，制備高尿酸血癥模型[10-12]。B組為造模對照組，每天給予實驗組同體積的淀粉糊（濃度40 g/L）灌胃。C組腺嘌呤組，給予腺嘌呤20 mg/（kg·d）與混合淀粉糊灌胃。D組腺嘌呤淀粉糊組，給予腺嘌呤10 mg/（kg·d）與混合淀粉糊灌胃。E組腺嘌呤鳥嘌呤組，給予腺嘌呤10 mg/（kg·d）與鳥嘌呤10 mg/（kg·d）混合淀粉糊灌胃。F組鳥嘌呤組，給予鳥嘌呤20 mg/（kg·d）與混合淀粉糊灌胃。實驗持續14 d，末次灌胃后12 h進行剪尾采血，分離血清。并取肝臟組織，低溫下將組織修成1 mm×1 mm×2 mm大小長條形，浸泡于體積分數為2.5%戊二醛中保存。

1.3.2透射電鏡觀察 將肝組織樣品切至1 mm× 1 mm×1 mm大小，至于2.5%戊二醛固定4 h；0.1 mol/L磷酸緩沖液漂洗3次，10 min/次；1%鋨酸固定1 h，pH 7.3；0.1 mol/L磷酸緩沖液漂洗3次，10 min/次；丙酮脫水，在30%、50%、70%、80%、90%丙酮中依次脫水10 min，100%丙酮脫水3次，10 min/次；丙酮溶液，環氧樹脂（EPON812）包埋劑混合液（2∶1）浸透0.5 h；丙酮溶液，環氧樹脂（EPON812）包埋劑混合液（1∶2）浸透1.5 h；將樣品移到EPON812包埋劑中，溫箱固化。37、45、60 ℃ 24 h超薄切片機（Ultracue E）切片，厚度為1～10 μm，將切下的片子轉移到干凈的滴有蒸餾水的載玻片上，加溫，切片展平，干燥后經甲苯胺藍染色，光學顯微鏡觀察定位。超薄切片機（Ultracue E）切片至厚度50～70 nm；醋酸雙氧鈾染色15 min后，徹底水洗3次；檸檬酸鉛染色15 min后徹底水洗3次；透視電鏡下觀察。

1.4統計學處理 采用SPSS 22.0統計學軟件進行數據處理，計量資料以（±s）表示，比較采用配對t檢驗或單因素方差分析，兩兩比較采用HSD檢驗法，以P<0.05表示差異有統計學意義。

2　結果

2.1各組大鼠血清尿酸值變化 B～F組初始與造模后的血尿酸值比較差異均有統計學意義（P<0.05），提示造模成功，見表1。

表1　各組大鼠造模前后血清尿酸值（±s） μmol/L

表1　各組大鼠造模前后血清尿酸值（±s） μmol/L

*與初始比較，P<0.05

組別　初始　造模后A組（n=6）　158.17±18.08　166.17±11.60 B組（n=6）　156.50±15.35　208.83±15.14*C組（n=6）　161.83±16.02　226.83±19.05*D組（n=6）　153.17±7.94　221.83±14.74*E組（n=6）　155.67±27.64　234.83±8.30*F組（n=6）　169.00±17.25　210.50±37.69*

2.2各組大鼠谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、血尿酸比較 C～F組谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶值與B組比較差異均有統計學意義（P<0.05），且組間兩兩比較差異有統計學意義（P<0.05）。C～E組血尿酸值與B組比較差異均有統計學意義（P<0.05）。C、D、E組大鼠的谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、血尿酸水平均高于F組，見表2。

表2　各組大鼠谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、血尿酸比較（±s）

表2　各組大鼠谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、血尿酸比較（±s）

組別　ALT（IU/L）　AST（IU/L）　UA（μmol/L）A組（n=6）　58.17±1.94　167.83±2.23　165.67±11.34 B組（n=6）　73.00±2.34　198.33±4.80　208.83±12.29 C組（n=6）　136.67±2.07　308.17±9.80　294.83±13.30 D組（n=6）　109.33±2.34　279.17±3.97　267.67±9.37 E組（n=6）　93.67±2.07　251.50±6.35　244.67±7.76 F組（n=6）　83.83±2.79　221.83±8.50　214.00±11.37

2.3各組大鼠肝臟透射電鏡觀察情況 A組肝臟細胞細胞核結構完整，細胞核核膜邊界清晰完整，線粒體結構正常，粗面內質網形態正常，有少量脂滴分布（圖1）。B組肝臟細胞核結構正常，細胞器形態結構均正常（圖2）。C組溶酶體、脂滴明顯增多，分散在細胞核周圍，并有深色顆粒物質（圖3）。D組溶酶體數量略有增多，脂滴增多，開始進入溶酶體（圖4）。E組溶酶體增多，脂滴增多，出現深色顆粒狀物質（圖5）。F組膽小管中有少量深色顆粒狀物質（圖6）。

圖1　A組大鼠肝細胞超微結構（×6000）

圖2　B組大鼠肝細胞超微結構（×20000）

圖3　C組大鼠肝細胞超微結構（×10000）

圖4　D組大鼠肝細胞超微結構（×20000）

圖5　E組大鼠肝細胞超微結構（×20000）

圖6　F組大鼠肝細胞超微結構（×60000）

3 討論

高尿酸血癥是一種嘌呤代謝紊亂癥狀，并且是痛風的前兆表現。它指的是血液中尿酸濃度高出正常范圍的一種機體狀態[13]。本實驗通過連續灌胃酵母浸膏溶液，造模高尿酸血癥大鼠模型[10-12]，造模后大鼠體重較重，飲食飲水正常。經檢驗，造模后血檢血尿酸值與初始水平比較差異有統計學意義（P<0.05）。對比均值，造模后血尿酸值明顯增高。

實驗中，分組施加處理因素后，大鼠谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶組間差異有統計學意義（P<0.05）。根據各組均值比較，結果表明，腺嘌呤致使大鼠谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶水平顯著升高，其作用高于同等劑量的鳥嘌呤。腺嘌呤鳥嘌呤混合作用時，其谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶水平低于腺嘌呤淀粉糊組，不能排除鳥嘌呤與腺嘌呤之間存在相互作用的可能性。大鼠血尿酸結果顯示，鳥嘌呤對實驗中大鼠的血尿酸水平的影響小于腺嘌呤，對比可見腺嘌呤對血尿酸水平有明顯作用。

本實驗通過觀察大鼠肝臟細胞超微結構，發現造模后的高尿酸血癥大鼠，在灌胃不同濃度的腺嘌呤、鳥嘌呤后，均有不同程度的變化。其中，單純施加鳥嘌呤的大鼠，超微結構改變較輕，與正常大鼠肝臟形態較為接近。結合血清檢測指標，可以看出鳥嘌呤對高尿酸血癥大鼠的肝臟損害較輕。實驗中，C、D、E三組大鼠分別施加了不同程度的腺嘌呤，三組大鼠的透射電鏡切片可看到較為清晰的結構改變。結合血清檢測可以看出，腺嘌呤對高尿酸血癥大鼠的肝臟有一定的毒性作用。主要表現在溶酶體不同程度的增多，脂滴進入溶酶體，并引起溶酶體破裂。膽小管處有深色顆粒狀物質沉積。其中C組腺嘌呤組的腺嘌呤施加量最多，肝臟超微結構的改變也最為明顯。

腺嘌呤是一種含氮雜環嘌呤類化合物，在體內代謝的最終產物為尿酸[14-15]。大鼠進行腺嘌呤灌胃后，磷酸核糖焦磷酸和/或谷酰胺增加，谷酰胺磷酸核糖焦磷酸轉移酶及黃嘌呤氧化酶活性亦增加，促進尿酸合成，進一步加重高尿酸血癥大鼠尿酸代謝負荷[16-18]，致使實驗組大鼠肝腎損傷。另外，腺嘌呤在體內代謝時，黃嘌呤氧化酶介導的氧自由基生成增加，亦可引發肝臟損傷[19-20]。以往研究發現腺嘌呤對大鼠腎臟的影響較為明顯[14，16-17]，本實驗中研究肝臟超微結構變化，亦有相似之處。有關腺嘌呤與鳥嘌呤之間的具體作用機制仍需進一步研究。

綜上所述，建議高尿酸血癥及痛風患者的飲食指導中，控制嘌呤攝入總量的基礎上，控制腺嘌呤的攝入量。對痛風患者的并發癥及其他慢性癥狀的控制有較好的作用。

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Studies of Hepatic Lesion on Hyperuricemia Rat-model Induced by Adenine and Guanine

SONG Yan-jun，YU Wei-sen，YIN Fan，et al.

Medical Innovation of China，2016，13（23）：013-016

Objective：To observe adenine and guanine effect liver function of hyperuricemia-model rat，and the changes under ultra microstructure.Method：The 36 male Wistar rats were randomly divided into 6 groups （A-control group，B-model group，C-adenine group，D-adenine starch paste group，E-adenine and guanine group，F-guanine group），each group of 6 cases.Groups B， C， D， E， F continuously given Yeast Extract Solution 15 g/（kg·d） to fill the stomach，7 days induced hyperuricemia-model rats.After the success of the building，group B for starch paste to fill the stomach.Group C：20 mg/（kg·d） adenine starch paste mixture.Group D：10 mg/（kg·d） adenine starch paste mixture.Group E：10 mg/（kg·d） adenine mixed 10 mg/（kg·d） guanine starch suspension.Group F：20 mg/（kg·d） guanine starch paste mixture to fill the stomach.For 14 days，the determination serum ALT，AST，UA and liver tissue electron microscope observation of liver injury of each group rats.Result：（1）Ultra microstructure observation the lysosome of group C increased obviously，scattered around the nucleus，and had dark grain material.Group D lysosome amount increased slightly，increased lipid drops，enter the lysosome.Group E the amount of lysosome increasing， increased lipid droplets， appear dark granular material.Group F bile duct in a small dark granular material.（2）ALT，AST of C-F groups were compared with group B，the differences were statistically significant（P<0.05），UA of C-E groups were compared with group B，the differences were statistically significant（P<0.05）.And ALT，AST，UA levels of group C，D，E were higher than group F.Conclusion：Adenine and guanine both lead to liver damage of hyperuricemia-model rats. Adeninecause ALT and AST levels significantly in hyperuricemia-model rats， the effect is higher than the same dose of guanine.Adenine has obvious effect to rat blood uric acid levels.

Adenine； Hyperuricemia； Guanine； Liver damage； Ultra microstructure

青島市衛計委立項項目（2010-WSZD099）

①青島大學醫學院公共衛生學院 山東 青島 266021

②山東省青島市疾病預防控制中心

宋揚

10.3969/j.issn.1674-4985.2016.23.004

2016-04-12） （本文編輯：蔡元元）