沙棘品種深秋紅莖尖組織培養(yǎng)

霍 川，趙 英，3*，張西珍，韓曉燕，牛建新，4*

(1.石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院園藝系，新疆石河子 832003；2.阿勒泰小漿果研究中心，新疆阿勒泰 836500； 3.新疆林業(yè)廳林果辦，新疆烏魯木齊 830000； 4.特色果蔬栽培生理與種質(zhì)資源利用兵團(tuán)重點實驗室，新疆石河子 832003)

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沙棘品種深秋紅莖尖組織培養(yǎng)

霍 川1，2，趙 英1，2，3*，張西珍1，2，韓曉燕2，牛建新1，2，4*

(1.石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院園藝系，新疆石河子 832003；2.阿勒泰小漿果研究中心，新疆阿勒泰 836500； 3.新疆林業(yè)廳林果辦，新疆烏魯木齊 830000； 4.特色果蔬栽培生理與種質(zhì)資源利用兵團(tuán)重點實驗室，新疆石河子 832003)

[目的]篩選沙棘品種深秋紅莖尖組織培養(yǎng)基配方。[方法]選用不同培養(yǎng)基，以7月中旬至8月下旬采集的大田莖尖為外植體，對沙棘品種深秋紅的組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行研究。[結(jié)果]最適初代培養(yǎng)基為1/2MS+6-BA 0.5 mg/L，最適愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為1/2MS+6-BA 0.5 mg/L +IBA 0.5 mg/L，最適繼代培養(yǎng)基為1/2MS+6-BA 0.5 mg/L +IBA 0.2 mg/L，最適腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為1/2MS+6-BA 0.5 mg/L。[結(jié)論]該研究建立了沙棘品種深秋紅莖尖組織培養(yǎng)技術(shù)，為其產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

沙棘；莖尖；組織培養(yǎng)

沙棘(HippophaerhamnoidesL.)為胡頹子科(Elaeagnaceae)沙棘屬(HippophaeL.)落葉灌木或小喬木，根系發(fā)達(dá)，枝葉茂密，適應(yīng)能力極強(qiáng)，抗嚴(yán)寒，抗風(fēng)沙耐干旱，是土壤貧瘠和沙漠化地區(qū)水土保持的先鋒樹種。沙棘主要生長在干旱、半干旱地區(qū)，抗逆能力強(qiáng)，有廣泛的適應(yīng)性，我國西北、華北、東北、西南各省均有分布，是一種集社會效益、生態(tài)效益、經(jīng)濟(jì)效益于一身的珍貴樹種。近年來，沙棘以其獨有的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)上的雙重優(yōu)勢越來越受到廣泛關(guān)注，逐漸成為我國山區(qū)的一種寶貴植物資源。

隨著西部大開發(fā)步伐的加快，山區(qū)綠化、生態(tài)農(nóng)業(yè)建設(shè)急需大量的沙棘苗木，傳統(tǒng)的分株繁殖、幼枝扦插繁殖已無法滿足需要，而組織培養(yǎng)育苗由于不受季節(jié)和地域限制，既能達(dá)到快速繁育的目的，又能很好地保持良種特性的優(yōu)勢，尤其可對雌雄異株的沙棘做定性繁育，具有很大的發(fā)展前景。沙棘組織培養(yǎng)研究已有相關(guān)報道[1-6]，但尚無可用于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的報道及配方。筆者以阿勒泰地區(qū)重點發(fā)展品種之一深秋紅為試驗材料，對其組織培養(yǎng)配方進(jìn)行篩選，為今后產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1試驗材料供試材料于2015年7月中旬至8月下旬采于阿勒泰市沙棘莊園，取成年植株當(dāng)年生枝條的莖尖為外植體。

1.2試驗方法

1.2.1初代培養(yǎng)。以莖尖為試材，先用自來水沖洗，再用洗潔精浸泡10 min，期間不斷攪拌，然后用流動自來水清洗15 min，蒸餾水沖洗3遍，之后裝入消毒燒杯中立即置于超凈工作臺上，用0.1% HgCl2消毒3 min，期間不斷振搖，最后用滅菌蒸餾水沖洗6次。 將莖尖放在滅菌的濾紙上將水分吸干，切成0.5～1.5 cm長，將莖尖基部葉片剝離，接種于初代培養(yǎng)基上，每瓶接種3個莖尖。初代培養(yǎng)基分別以1/2MS和1/3MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的6-BA、IBA和NAA。初始培養(yǎng)基設(shè)計10個處理：①1/2MS+6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.5 mg/L；②1/2MS+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.5 mg/L；③1/2MS+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.2 mg/L；④1/3MS+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.2 mg/L；⑤1/3MS+6-BA 0.2 mg/L+IBA 0.2 mg/L；⑥1/2MS+6-BA 0.5 mg/L；⑦1/2MS+6-BA 0.2 mg/L；⑧1/2MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L；⑨1/3MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.05 mg/L；⑩1/3MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.02 mg/L。

1.2.2繼代培養(yǎng)。

1.2.2.1莖尖基部愈傷組織誘導(dǎo)。誘導(dǎo)愈傷組織時，將高于2 cm的初代芽接種至以1/2MS和1/3MS為基本培養(yǎng)基的繼代培養(yǎng)基上，添加不同濃度的6-BA和IBA。愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基設(shè)計4個處理：①1/2MS+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.5 mg/L；②1/2MS+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.2 mg/L；③1/3MS+6-BA 0.2 mg/L+IBA 0.2 mg/L；④1/2MS+6-BA 0.3 mg/L+IBA 0.05 mg/L。

1.2.2.2增殖培養(yǎng)。將初代無菌苗切下，再將莖尖和帶有2～3片葉的莖段切分，莖尖接種至1/2MS+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.2 mg/L繼代培養(yǎng)基上，帶腋芽的莖段接種至1/2MS+6-BA 0.5 mg/L繼代培養(yǎng)基上。

1.3培養(yǎng)條件蔗糖30 g/L，瓊脂6 g/L，每瓶分裝培養(yǎng)基25～35 mL，pH 5.6～6.0，培養(yǎng)室溫度20～26 ℃，濕度40%～60%，光照強(qiáng)度2 000 lx，光照時間12～14 h/d 。

2　結(jié)果與分析

2.1初代培養(yǎng)的建立由表1可知，沙棘初代莖尖在培養(yǎng)基⑥和⑦上長勢最好。在培養(yǎng)基①、②、⑤、⑧上萌發(fā)率低或生長較慢，其他培養(yǎng)基長勢一般。6-BA濃度在0.2～0.5 mg/L未添加任何生長素時，對于7月中旬至8月下旬的莖尖有較好的側(cè)芽誘導(dǎo)效果，生長快，分化芽數(shù)最多。當(dāng)6-BA濃度在0.5 mg/L時，添加不同濃度的生長素IBA，結(jié)果表明，濃度低于0.2 mg/L時生長迅速，但后期易死亡，濃度達(dá)0.5 mg/L時，基部愈傷組織開始形成。而6-BA與NAA的組合則不適合深秋紅初代培養(yǎng)。其中，培養(yǎng)基⑥即1/2MS+6-BA 0.5 mg/L成活率可達(dá)92.3%，平均分化芽數(shù)可達(dá)2.53，為適宜初代培養(yǎng)基(圖1)。

表1　不同培養(yǎng)基配方對初代培養(yǎng)的影響

圖1　初代莖尖組織培養(yǎng)Fig.1　Primary stem tip tissue culture

2.2愈傷組織的誘導(dǎo)將初代培養(yǎng)萌發(fā)的2～3 cm的側(cè)芽無菌苗切下，轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基中，成功誘導(dǎo)出愈傷組織。適合誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基是1/2MS+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.5 mg/L，誘導(dǎo)率達(dá)100%。在此培養(yǎng)基上，無菌苗生長迅速，15 d左右根部切口部位開始膨大，愈傷組織為黃綠色，繼續(xù)培養(yǎng)至30 d左右時，莖尖生長緩慢或停止，根部愈傷組織明顯增大，直徑可達(dá)1.5 cm左右，當(dāng)培養(yǎng)至40 d左右時，愈傷組織變深褐色失去活力甚至開始死亡。而在培養(yǎng)基1/2MS+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.2 mg/L上愈傷組織誘導(dǎo)率為66.3%，愈傷組織塊較培養(yǎng)基1/2MS+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.5 mg/L的體積小，30 d時直徑約1 cm，繼續(xù)培養(yǎng)至40 d以上時，由愈傷組織萌發(fā)出少量芽，但愈傷組織轉(zhuǎn)黑褐色，萌發(fā)的芽有玻璃化現(xiàn)象，無法正常生長(表2、圖2)。

2.3繼代培養(yǎng)將初代形成的株高3 cm以上的無菌苗截成帶腋芽莖段誘導(dǎo)增殖，轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)，經(jīng)20 d左右培養(yǎng)后，當(dāng)新芽高2 cm以上時，再切分成小段轉(zhuǎn)接誘導(dǎo)增殖以達(dá)到擴(kuò)繁的目的。莖尖在1/2MS+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.2 mg/L上長勢迅速，莖段在1/2MS+6-BA 0.5 mg/L上誘導(dǎo)腋芽萌發(fā)生長效果較好。但腋芽增殖系數(shù)較低，平均誘導(dǎo)腋芽數(shù)也少，難以滿足快繁的要求(表3、圖3、4)。

表2　不同培養(yǎng)基配方對愈傷組織誘導(dǎo)的影響

圖2　沙棘苗根部誘導(dǎo)的愈傷組織Fig.2　Callus induced by seabuckthorn roots

表3　沙棘品種深秋紅繼代培養(yǎng)效果

圖3　繼代莖尖組織培養(yǎng)Fig.3　Subculture of stem tip

圖4　繼代莖段誘導(dǎo)腋芽萌發(fā)Fig.4　Axillary buds germination induced by subculture of stem tip

3　結(jié)論與討論

該研究以7月中旬至8月下旬采集的大田莖尖為外植體，對沙棘品種深秋紅組織培養(yǎng)進(jìn)行研究。結(jié)果表明，適宜初代培養(yǎng)基為1/2MS+6-BA 0.5 mg/L，適宜愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為1/2MS+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.5 mg/L，適宜繼代培養(yǎng)基為1/2MS+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.2 mg/L，適宜腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為1/2MS+6-BA 0.5 mg/L。

在初代培養(yǎng)時，單一使用細(xì)胞分裂素效果優(yōu)于細(xì)胞分裂素和細(xì)胞生長素配合使用，其原因可能是此階段的內(nèi)源生長素含量較高。 在誘導(dǎo)腋芽時發(fā)現(xiàn)，通常一個葉腋著生一個腋芽，但繁殖系數(shù)偏低，原因可能是尚未篩選出最適的培養(yǎng)基配方。

褐化是沙棘組織培養(yǎng)中常見的問題，其創(chuàng)傷分泌出的酚類物質(zhì)一旦接觸空氣便被氧化成醌類有毒物質(zhì)，這些有毒物質(zhì)積累在培養(yǎng)基中而使培養(yǎng)材料死亡[7]。在木本植物組織培養(yǎng)過程中，褐變受培養(yǎng)溫度、外植體、激素濃度、光照等因素的影響[8～10]。在該試驗中，外植體接種前進(jìn)行低溫處理，即將沖洗過后的外植體密封置于4～6 ℃環(huán)境中3～5 h后接種，褐化現(xiàn)象受到一定程度的抑制，原因是低溫使外植體代謝速度減緩，減少了醌類物質(zhì)的形成[11]。

通過對沙棘品種深秋紅進(jìn)行組織培養(yǎng)試驗，發(fā)現(xiàn)不同樹齡、部位等的植株間外植體的差異對生長增殖影響較大。該試驗雖已獲得初步成功，但尚未達(dá)到快速繁殖及工廠化生產(chǎn)的目的，尚有許多問題有待進(jìn)一步研究。

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Tissue Culture of Stem Tip of Seabuckthorn Variety Shenqiuhong

HUO Chuan1, 2, ZHAO Ying1, 2, 3*, ZHANG Xi-zheng1, 2, NIU Jian-xin1, 2, 4*et al

(1. Department of Horticulture, College of Agriculture, Shihezi University, Shihezi, Xinjiang 832003; 2. Altay Berries Research Center, Ataile，Xinjiang 836500; 3. Fruit Office of Xinjiang Forestry Department, Urumqi, Xinjiang 830000; 4. Xinjiang Production and Construction Corps Key Laboratory of Special Fruits and Vegetables Cultivation Physiology and Germplasm Resources Utilization, Shihezi, Xinjiang 832003)

[Objective] The aim was to screen out culture medium formula for stem tip of seabuckthorn variety Shenqiuhong. [Method] By using different culture mediums, with stem tip collected from middle Jul. to late Aug. as explants, tissue culture technology of seabuckthorn variety Shenqiuhong was studied. [Result] The optimal primary culture medium was 1/2MS+6-BA 0.5 mg/L, the optimal callus induction culture medium was 1/2MS+6-BA 0.5 mg/L +IBA 0.5 mg/L, the optimal subculture medium was 1/2MS+6-BA 0.5 mg/L +IBA 0.2 mg/L, the appropriate axillary bud induction medium was 1/2MS+6-BA 0.5 mg/L. [Conclusion] The cultivation technique for stem tip of seabuckthorn variety Shenqiuhong is established, which will lay a foundation for industrialized production.

Seabuckthorn; Stem tip; Tissue culture

中央財政林業(yè)科技推廣示范項目(ZYLYKJTG2015014)。

霍川(1992- )，男，河南太康人，碩士研究生，研究方向：沙棘組織培養(yǎng)。*通訊作者，趙英，高級工程師，博士，碩士生導(dǎo)師，從事沙棘良種選育和開發(fā)利用研究；*通訊作者，牛建新，教授，博士，博士生導(dǎo)師，從事果樹與生物技術(shù)研究。

2016-05-26

S 723.1

A

0517-6611(2016)18-127-03