7種不同來源靈芝熱水提物體外抗氧化活性研究

聶 健，楊水蓮，莫美華，胡智豪

(華南農業大學食品學院，廣東廣州 510642)

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7種不同來源靈芝熱水提物體外抗氧化活性研究

聶 健，楊水蓮，莫美華*，胡智豪

(華南農業大學食品學院，廣東廣州 510642)

[目的]比較不同地區靈芝熱水提物的體外抗氧化活性。[方法]分別從總還原力、清除羥基自由基(·OH)、超氧陰離子自由基(O2-·)和DPPH自由基4個方面對7種靈芝子實體熱水提物的體外抗氧化活性進行了初步研究。[結果]在相同濃度下，貓兒山野生靈芝熱水提物的總還原力最強，吸光度高達2.48；·OH清除能力最高，清除率99.46%；清除DPPH自由基能力最強，清除率為96.62%；清除O2-·能力排第三。[結論]貓兒山野生靈芝熱水提取物在總還原力、清除·OH、DPPH自由基3個方面的抗氧化能力表現出最強，說明貓兒山野生靈芝具有非常好的開發潛力。

靈芝；體外；抗氧化性；熱水提取物；不同來源

靈芝Ganodermalucidum(Leyss.ex.Fr.)Karst 是一種珍貴藥用真菌，屬于真菌界、真核真菌亞界、真菌門、擔子菌亞門、層菌綱、非褶菌目、靈芝菌科(Ganoderma taceae)、靈芝屬(Ganoderma)的大型真菌[1]。世界上靈芝科的種類主要分布在亞洲、澳洲、非洲及美洲的熱帶和亞熱帶，少數分布于溫帶。地處北半球溫帶的歐洲僅有靈芝屬的 4 種，而北美洲大約 5 種[2]。我國地跨熱帶至寒溫帶，靈芝科種類多而分布廣。國內外大量的研究結果證明，靈芝具有較重要、廣泛的藥理作用且毒性極低，它具有抗細菌[3-4]、抗真菌[5]、抗病毒[6-7]、抗癌[8]等功效。靈芝的生物活性成分十分豐富，目前已從靈芝子實體、孢子和菌絲中分離到 300 多種化合物，可分為三萜類、多糖類、核苷類、呋喃類、生物堿類、蛋白質多肽類、脂肪酸、糖蛋白、甾醇類、有機鍺、礦質元素等[9]。由于靈芝獨特的藥用價值，有關靈芝的栽培技術、有效成分的提取、分離、純化以及其生物學活性和藥理價值的研究已引起了國際上的廣泛關注[10-16]。

目前，研究表明人類的許多慢性疾病和衰老現象均與人體內的自由基水平失衡有關[17-19]。清除自由基等抗氧化研究越來越受到重視，除了維生素類、氨基酸類抗氧化劑之外，從植物、菌類等生物來源的化合物中的天然抗氧化劑，由于其安全性高、無副作用而受到廣泛關注。但這類天然化合物的提取過程復雜，多為純品，成本較高，如提取出靈芝中的多糖或三萜，而對于這類生物粗提物的抗氧化作用研究較少[20]。筆者以不同地區的多種靈芝子實體(貓兒山野生靈芝、陽江海靈芝、長白山靈芝、方回春堂靈芝、泰山靈芝、黃山靈芝、日本靈芝)為材料，比較分析了它們的熱水提物的體外抗氧化活性，為不同靈芝的開發利用提供理論依據，也為靈芝優良菌種選育奠定了基礎。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1試材。陽江海靈芝，采于廣東省陽江市閘坡，由華南農業大學食品學院應用微生物實驗室馴化栽培；貓兒山野生靈芝，采自廣西貓兒山國家自然資源保護區；長白山靈芝，采自吉林長白山；泰山靈芝，采自山東泰山；黃山靈芝，采自黃山云樂基地；方回春堂靈芝，采自福建莆田；日本靈芝，取自廣西宏旺菌業發展有限公司。

1.1.2試劑藥品。磷酸，分析純，成都市聯合化工試劑研究所；鐵氰化鉀，分析純，天津市百世化工有限公司；三氯乙酸(TCA)，分析純，廣州化學試劑廠；三氯化鐵(FeCl3)，分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司；番紅花，分析純，廣州化學試劑廠；EDTANa2，分析純，廣州市威佳科技有限公司；磷酸二氫鈉，分析純，廣州化學試劑廠；磷酸氫二鈉，分析純，廣州化學試劑廠；過氧化氫(H2O2)，分析純，廣州化學試劑廠；硫酸亞鐵(FeSO4)，分析純，天津科密歐化學試劑有限公司；鄰苯三酚，分析純，天津市副晨化學試劑廠；Tris，分析純，廣州化學試劑廠；鹽酸(HCl)，分析純，廣州化學試劑廠；95%乙醇，分析純，天津市富宇精細化工有限公司；DPPH(二苯基苦味酰基苯肼)，分析純，梯希愛(上海)化成工業發展有限公司。1.1.3儀器。METTLER AE 100 電子分析天平，中國上海精科天平廠；H-1微型渦旋混合器，上海精科實業有限公司；新一佳HH-2恒溫水浴鍋，江蘇金上云市宏華儀器廠；UV-7500紫外可見分光光度計，中國上海精密科學儀器有限公司；KDC-140HK臺式高速冷凍離心機，安徽中科中佳科學儀器有限公司；昆山舒美KQ-600雙頻超聲波清洗器，昆山舒美超聲儀器有限公司；Sartorius普及型pH計(PB-10)，北京賽多利斯儀器系統有限公司；YB-500A型高速多功能粉碎機，上海力箭機械有限公司。

1.2方法

1.2.1不同來源靈芝熱水提物總還原力測定。

1.2.1.1試劑配制。0.2 mol/L NaH2PO4溶液：稱取NaH2PO4·2H2O 31.2 g(或NaH2PO4·H2O 27.6 g)加重蒸水1 000 mL即得。0.2 mol/L Na2HPO4溶液：稱取Na2HPO4·12H2O 71.632 g(或Na2HPO4·7H2O 53.6 g 或Na2HPO4·2H2O 35.6 g)加重蒸水1 000 mL即得。0.2 mol/L pH 6.6的磷酸緩沖溶液：取62.5 mL 0.2 mol/L NaH2PO4加入37.5 mL 0.2 mol/L Na2HPO4，即得。1%鐵氰化鉀溶液：準確稱取1 g鐵氰化鉀，加水溶解，定容至100 mL 棕色瓶中，保存備用。10%三氯乙酸(TCA)溶液：準確稱取10 g TCA，加水完全溶解后，定容至100 mL棕色容量瓶中，保存備用。0.1% FeCl3：準確稱取0.1 g FeCl3，加水完全溶解后，定容至100 mL，棕色容量瓶中，保存備用。

1.2.1.2總還原力測定。參照文獻[21-22]的測定方法并略有修改。在2 mL 0.2 mol/L pH 6.6的磷酸緩沖溶液中加入2 mL樣品、2 mL 1%鐵氰化鉀，混勻，混合物在50 ℃恒溫條件下加熱20 min，急速冷卻到室溫，加2 mL 10%三氯乙酸，充分混勻，4 ℃ 3 000 r/min離心10 min，取上層清液2 mL，加2 mL水，再加0.4 mL 0.1% FeCl3，混合均勻，靜置10 min后在700 nm下測吸光度A700。每個處理3個重復。

1.2.2不同來源靈芝熱水提物對羥基自由基(·OH)的清除作用。

1.2.2.1試劑配制。6 mmol/L FeSO4：精確稱取0.166 8 g FeSO4·7H2O，溶于適量水中，最后定容至100 mL。6 mmol/L H2O2：30% H2O2溶液相當于10 mol/L，配制時將0.06 mL 30%H2O2溶液稀釋至100 mL即可。6 mmol/L水楊酸：稱取0.082 8 g水楊酸溶于適量水中，定容至100 mL，置棕色瓶中保存。

1.2.2.2清除率計算。參考Smirnoff等[23]測定方法并略有修改，在10 mL的試管中依次加入6 mmol/L FeSO4溶液1 mL、樣品溶液1 mL、6 mmol/L H2O2溶液1 mL，搖勻，靜置10 min，再加入6 mmol/L 水楊酸溶液1 mL，搖勻，靜置30 min后，以雙蒸水為參比，于510 nm處測其吸光值。清除率計算公式為：清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%，式中，A0為用水代替樣品溶液時測得的吸光度；Ai為不同樣品液下測得的吸光度；Aj為水代替水楊酸時不同樣品溶液測得的本底吸光度。

1.2.3不同來源靈芝熱水提物對超氧陰離子自由基(O2-·)清除作用。

1.2.3.1試劑配制。0.1 mol/L HCl 溶液：取1 mL濃鹽酸定容至100 mL即可。pH 8.0 0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液：取Tris 0.61 g、EDTANa20.037 g用雙蒸水溶解至98 mL左右，用HCl調節pH=7.9，最后定容至100 mL。10 mmol/L HCl溶液：取100 μL濃鹽酸定容至100 mL即可。50 mmol/L鄰苯三酚溶液：稱取鄰苯三酚0.063 g，用10 mmol/L HCl溶液溶解，定容至10 mL，避光，冷凍保存。

1.2.3.2清除率計算。參照Marklund等[24]測定方法并略有修改，取0.05 mol/L Tris-HCl(pH =8.2)緩沖液4.4 mL于試管中，置于25 ℃水浴中預熱25 min，加入不同濃度測試液0.10 mL，2.5 mmol/L鄰苯三酚0.5 mL，以蒸餾水為空白，混勻，于25 ℃恒溫水浴中準確反應4 min，立即用10 mol/L HCl 2滴終止反應，并在299 nm處測其吸光度值。清除率計算公式為：清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/Ac]×100%，式中，Ac為用水代替樣品溶液時測得的吸光度；Ai為不同樣品溶液下測得的吸光度；Aj為水代替鄰苯三酚時不同樣品溶液下測得的本底吸光度。

1.2.4不同來源靈芝熱水提物對DPPH自由基清除作用。參照Brand-Williams等[25]測定方法并略有修改，準確稱取20 mg DPPH用95%乙醇溶解并定容于250 mL 容量瓶中，得濃度為0.2 mmol/L的DPPH溶液，于棕色瓶中4 ℃保存。將樣品溶液 2 mL與2 mL 2 ×10-4mol/L DPPH 溶液均勻混合，避光反應30 min 后在 517 nm 處測定其吸光度(Ai)，同時用同法測定2 mL 2×10-4mol/L DPPH溶液與2 mL溶劑混合后的吸光度(Ac)，以及 2 mL提取液與 2 mL 溶劑混合后的吸光度(Aj)。清除率計算公式為：清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/Ac]×100%，式中，Ac為用水代替樣品溶液時測得的吸光度；Ai為不同樣品溶液下測得的吸光度；Aj為95%乙醇代替DPPH時不同來源樣品溶液下測得的本底吸光度。

2　結果與分析

2.1不同來源靈芝熱水提物總還原力的測定由圖1可知，不同來源的靈芝在同一熱水提取物濃度下(4 mg/mL)，總還原力有顯著性差異。其中貓兒山野生靈芝的總還原力遠高于其他幾種靈芝，吸光度達2.48，最低為陽江海靈芝，吸光度為0.3，總還原力由高到低依次為貓兒山野生靈芝、日本靈芝、方回春堂靈芝、長白山靈芝、黃山靈芝、泰山靈芝、陽江海靈芝。

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。Note:Different lowercases indicated significant differences (P<0.05)。圖1　不同來源靈芝熱水提物總還原力Fig.1　Reducing power of hot water extracts from different sources of G.lucidum

2.2不同來源靈芝熱水提物清除羥基自由基(·OH)的測定從圖2可以看出，不同來源的靈芝熱水提取物在同一濃度下(10 mg/mL)清除·OH能力有顯著性差異。其中貓兒山野生靈芝熱水提取物對·OH清除能力最高，清除率為99.46%，陽江海靈芝清除率為96.3%，兩者差異不顯著(P>0.05)，長白山靈芝熱水提取物清除·OH能力最弱，清除率為17.94%。羥基自由基清除能力由高到低依次為貓兒山野生靈芝、陽江海靈芝、黃山靈芝、日本靈芝、泰山靈芝、方回春堂靈芝、長白山靈芝。

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05-)。Note:Different lowercases indicated significant differences (P<0.05)。圖2　不同來源靈芝熱水提物清除羥基自由基(·OH)效果Fig.2　Hydroxyl radical (·OH)scavenging of hot water extracts from different sources of G.lucidum

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。Note:Different lowercases indicated significant differences (P<0.05)。圖3　不同來源靈芝熱水提物清除超氧陰離子自由基·)效果Fig.3　Superoxide radical ·)scavenging of hot water extracts from different sources of G.lucidum

2.4不同來源靈芝熱水提物清除DPPH自由基的測定從圖4可以看出，不同來源靈芝熱水提取物在同一濃度下(2 mg/mL)清除DPPH自由基能力有顯著性差異。其中貓兒山野生靈芝熱水提取物清除DPPH自由基能力最高，清除率為96.62%；陽江海靈芝熱水提取物清除DPPH自由基能力最弱，清除率為30.78%。DPPH自由基清除能力由高到低依次為貓兒山野生靈芝、長白山靈芝、方回春堂靈芝、日本靈芝、泰山靈芝、黃山靈芝、陽江海靈芝。

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。Note:Different lowercases indicated significant differences (P<0.05)。圖4　不同來源靈芝熱水提物清除DPPH自由基效果Fig.4　DPPH radlcal scavenging of hot water extracts from different sources of G.lucidum

3　結論與討論

該試驗通過清除DPPH、羥基自由基、超氧陰離子自由基活性及還原力能力4個體外抗氧化模型的測定，對不同來源

靈芝子實體熱水提取物體外抗氧化性進行了比較研究，發現各種靈芝子實體熱水提取物均有不同程度的體外抗氧化能力。但此次試驗僅測定了同一濃度下不同來源靈芝的熱水提取物體外抗氧化性，即通過預試驗將熱水提取物濃度調整到一個適宜比較的濃度進行橫向比較，沒有將水提物稀釋成不同濃度梯度測定EC50，通常當EC50值低于10 g/L，表明真菌提取物具有很好的體外抗氧化活性[26]。從自由基清除率的比較可看出，靈芝熱水提取物均具有較強的體外抗氧化活性，且不同的靈芝熱水提取物抗氧化能力有顯著差異，表明靈芝熱水提取物對人體的氧化損傷有較好的保護作用。因為Lee等[26]研究表明熱水提取物主要組成成分為粗多糖。說明貓兒山野生靈芝粗多糖具有較強的生理活性，粗多糖的分離純化、結構鑒定以及抗氧化機理研究，還有待于進一步深入探討。

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Antioxidant Activity of Hot Water Extracts from Seven Different Sources ofGanodemalucidum

NIE Jian, YANG Shui-lian, MO Mei-hua*et al

(College of Food Science, South China Agricultural University, Guangzhou, Guangdong 510642)

Ganodermalucidum; In vitro; Antioxidant activity; Hot water extracts; Different sources

聶健(1989- )，男，江西樂安人，碩士研究生，研究方向：靈芝活性成分。*通訊作者，副教授，博士，碩士生導師，從事食藥用菌資源開發利用研究。

2016-04-15

S 567.3+1

A

0517-6611(2016)18-134-03

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