重金屬Cu2+對四角蛤蜊的急性毒性及肝臟組織結構的影響

宮春光　殷蕊　孫桂清　于清海　王其增　崔健斌

摘要：在水溫（12±0.5）℃、鹽度27‰的環境下，研究了重金屬Cu²⁺對四角蛤蜊的急性毒性效應和肝臟組織結構的影響。結果表明，Cu²⁺對四角蛤蜊24、48、96h LC₅₀分別為13.4、7.34和4.32mg/L；安全濃度分別為0.13、0.07和0.04mg/L。通過對Cu²⁺暴露在不同濃度96h的四角蛤蜊肝臟組織切片觀察發現，Cu²⁺對四角蛤蜊的肝臟組織結構有明顯影響，肝臟的損傷程度隨著Cu²⁺濃度的增加而加深，2.59mg/L為四角蛤蜊肝臟解毒的閾值。

關鍵詞：重金屬；四角蛤蜊；急性毒性；肝臟

四角蛤蜊（Mactra veneriformis Reeve）屬軟體動物門，瓣鰓綱，真瓣鰓目，蛤蜊科，是我國沿海地區一種重要的經濟貝類，通常生活在含泥沙較多的潮間帶，在我國南北沿海均有分布，因其肉質鮮美，營養價值高，深受國內外消費者的歡迎。近幾年，我國沿海地區的經濟發展速度較快，隨之而來的是大量工業廢水和生活污水排人海洋，給海洋生態環境帶來極大的負擔，在諸多污染物中，重金屬對海洋環境的影響尤為顯著。重金屬隨沿岸徑流排入海中后，容易在沿海的底泥中沉積，而四角蛤蜊為生活在泥沙中的底棲生物，又具有移動性差的特點，因而最易受到重金屬的影響；重金屬污染物可以在海洋生物體內或其某一組織中積累，通過生物富集和放大，直接或間接威脅人類的健康。在利用生物間的共生互補原理、運用生態學原理創建環境友好型養殖模式中，底棲貝類是一個重要的混養組合，通過貝類消耗掉其它養殖動物所排出的N，可以優化養殖環境，同時增加養殖效益，例如牙鲆和四角蛤蜊的池塘生態混養。國內外已進行過許多有關重金屬對魚類及底棲貝類的急性毒性研究，但有關重金屬Cu²⁺對四角蛤蜊的急性毒性效應和肝臟組織結構的影響尚未見報道。筆者研究了Cu²⁺對四角蛤蜊成貝的急性毒性效應，得出了24、48和96h半致死濃度和安全質量濃度；同時研究了暴露Cu²⁺不同濃度96h的情況下，對四角蛤蜊肝臟組織結構的影響。本實驗可為四角蛤蜊安全養殖和重金屬生態毒理學研究提供基礎性數據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗對象為成體四角蛤蜊，產地河北省黃驊市。四角蛤蜊進入實驗室后，暫養5d，期間定期投喂球等鞭金藻（3011），連續充氣，每日換水一次，換水量100%，暫養水溫在（12±0.5）℃。暫養期間貝類日死亡率低于5%后進行實驗，實驗前1d停止投餌，選擇健康、反應靈敏、個體均勻的四角蛤蜊隨機分組進行實驗，實驗貝類殼長（32.18±1.87）mm，殼高（28.23±1.36）mm，濕體質量（9.98±1.32）g。

CuSO₄·5H₂O為天津市科密歐化學試劑有限公司生產，含量≥99.0%，用超純水分別配制成含有Cu²⁺質量濃度為10g/L母液，實驗時根據不同濃度進行稀釋。試驗用水為人工配制海水，使用海水晶（天津市塘沽區海生海水晶廠出品）+雙蒸水配制而來，鹽度27‰，pH8.30。

1.2 實驗方法

1.2.1 急性毒性預實驗 使用15L水槽，加入4L配制海水和適量藥物母液，混勻后放人10只四角蛤蜊，保持實驗水溫在（12±0.5）℃，自然光照，實驗期間不換水，不充氣，不投餌。每個預實驗濃度做一組平行試驗，同時設一個對照組，取實驗數據平均值。24h、48h和96h后觀察死亡情況，以多次刺激無反應、雙殼張開、外套膜萎縮為判斷其死亡的標準進行計數。通過預實驗查明重金屬離子的不引起死亡的最大濃度（ILL）和最小100%致死濃度（LC₁₀₀）。

1.2.2 急性毒性實驗 經預實驗，Cu²⁺對四角蛤蜊不引起死亡的ILL為0.76mg/L，LC₁₀₀為43.18mg/L。在此Cu²⁺實驗濃度范圍內，按照等比級數設定11個濃度組，每組設3個平行，1個對照，每個水槽內隨機放人10只四角蛤蜊，實驗條件與預實驗條件保持一致，24h、48h和96h后觀察死亡情況并及時清除死亡個體。實驗重復一次，最終數據取平均值。

計算平均死亡率，再換算成概率單位，計算出實驗藥液質量濃度對數，求出概率單位與實驗藥液質量濃度對數的回歸方程，求出各自的半數致死濃度（LC₅₀）；安全濃度為LC₅₀×AF，其中AF為應用系數，對于穩定且又易于在生物體內積累的污染物，其系數多選在O.01～0.05范圍內。本實驗中重金屬離子屬于難分解、積累性強的物質，AF值取O.01。

1.2.3 肝臟組織切片的制備與觀察 取暴露不同濃度Cu²⁺96h的活體四角蛤蜊，解剖，取肝臟組織，用Bouin氏液固定、經自來水沖洗、梯度酒精脫水、透明、透蠟和石蠟包埋等步驟；后進行切片，切片厚度5μm；采用蘇木精-伊紅染色法（H.E）染色，BK5000顯微鏡觀察并拍照。

2 結果與分析

2.1 結果

2.1.1 中毒癥狀 不同實驗濃度下四角蛤蜊的中毒反應有所不同。實驗開始24h內，低于2.59mg/L濃度組的四角蛤蜊大部分都伸出了斧足和水管，而高于這個濃度組中的四角蛤蜊雙殼緊閉，其中高于13.03mg/L濃度組的部分個體黏液分泌明顯，最高濃度組的個體在24h全部死亡；24～48h內，2.59mg/L濃度組中的四角蛤蜊縮回了斧足和水管，同時低于此濃度實驗組中的四角蛤蜊有少數伸出斧足，0.76mg/L濃度組的個體則幾乎全部伸出斧足，高濃度組則雙殼緊閉，刺激無反應，水中漂浮大量粘絲，拿起四角蛤蜊，可見大量粘液掛在殼面上；48～96h內，受試四角蛤蜊的中毒現象越來越嚴重，出現外套膜脫落現象，高濃度組的死亡率接近100%，但0.76mg/L濃度組的個體則仍有部分個體伸出斧足，但相比對照組中的四角蛤蜊所伸出的斧足相對要小。總體上，Cu²⁺濃度越高，四角蛤蜊所排黏液就越多。中毒死亡的個體一部分雙殼張開，一部分雙殼緊閉，但幾乎均是外套膜、水管脫落。

2.1.2 急性毒性實驗結果 Cu²⁺對四角蛤蜊的急性毒性實驗具體結果見表1。

Cu²⁺對四角蛤蜊的半致死濃度及安全濃度見表2。

2.1.3 Cu²⁺對四角蛤蜊肝臟組織結構的影響

不同濃度Cu²⁺暴露96h對四角蛤蜊肝臟組織結構的影響見圖1-8。

2.2 分析

2.2.1 重金屬Cu²⁺對四角蛤蜊的急性毒性效應及毒性機理 本實驗在水溫（12±0.5）℃、鹽度27‰的環境下，研究了重金屬Cu²⁺對四角蛤蜊的急性毒性效應。結果表明，Cu²⁺對四角蛤蜊24、48、96hLC₅₀分別為13.43、7.34和4.32mg/L；安全濃度分別為0.13、0.07和0.04mg/L。王曉宇等研究了Hg²⁺和Cd²⁺對四角蛤蜊的急性毒性，96hLC₅₀分別為0.207和2.383mg/L，其中Cd²⁺的毒性比本實驗的Cu²⁺低，這與重金屬毒性的眾多研究報道趨勢（Hg²⁺>Cu²⁺>Cd²⁺）不符；但王曉宇的實驗水溫為（15±0.5）℃，而本實驗水溫為（12±0.5）℃，而多數重金屬的毒性與水溫呈正相關；另外，Lussier等研究了幾種重金屬和氰化物對巴西擬糠蝦（Mysidopsis bahia）的急性毒性效應，得到了各種重金屬對巴西擬糠蝦的96h半數致死濃度，研究發現毒性作用大小為Hg²⁺>Cd²⁺>Cu²⁺。因而，這種現象還有待于進一步研究。

實驗開始后，低濃度組的四角蛤蜊除最初受到人為刺激緊閉雙殼外，2h后大部分個體都伸出了斧足和水管；而高濃度組中的四角蛤蜊則始終雙殼緊閉，說明其受到Cu²⁺刺激后以閉殼的方式進行避毒。Cu²⁺是生物體必需金屬元素，是許多氧化酶的組成成分，但過量的Cu²⁺進人生物體內會催化氧化酶產生大量活性氧自由基團，導致脂質過氧化；另外Cu²⁺可使多種酶類及活性因子失去活性，從而破壞生物體的酶系統，阻斷其各種生化反應和新陳代謝活動，導致生物體死亡。

2.2.2 Cu²⁺對四角蛤蜊肝臟組織結構的影響 雙殼貝類分布廣、遷移性差、能高度富集水中污染物，因而是生物監測和毒理學最常被研究的群體之一。肝臟是四角蛤蜊的主要解毒和代謝功能器官，是重金屬Cu²⁺進入其體內的主要富集部位，當Cu²⁺進人體內后會催化氧化酶產生大量活性氧自由基團而造成氧化損傷，一旦超過肝臟的解毒能力，就會對肝臟的組織結構產生不同程度的影響，其組織病理學評價可用于鑒定Cu²⁺的污染程度。

本研究發現，Cu²⁺對四角蛤蜊肝臟組織結構的影響有明顯的濃度依賴性，Cu²⁺濃度越高，對肝臟的損傷就越明顯。當暴露Cu²⁺0.76mg/L時，肝臟組織只有輕微損傷，表現為肝小管輕微腫脹（見圖1）；但暴露Cu²⁺2.59mg/L時，肝臟組織損傷明顯，表現為肝小管上皮細胞和胃粘膜層壞死、明顯脫落（見圖5）；而暴露Cu²⁺5.79mg/L時，肝臟組織則出現了大范圍壞死，留下大面積壞死區（見圖7）；暴露Cu²⁺8.69mg/L時，肝臟組織大范圍壞死后已經完全失去消化腺的結構，只有部分肝小管留有輪廓（圖8），此時四角蛤蜊的肝臟已完全失去其生理功能。高于8.69mg/L濃度組的四角蛤蜊在96h前已全部死亡，因此沒有取樣切片。從實驗結果可以看出，Cu²⁺2.59mg/L濃度暴露96h時達到了四角蛤蜊肝臟解毒的閾值，高于此濃度會導致肝臟逐漸失去其代謝、解毒生理功能。

（收稿日期：2016-03-08）