重組魚類干擾素研究進展

孔德榮　王智誠　劉海映　王秀利

摘要：干擾素（Interferons，IFNs）是由免疫細胞分泌的能對幾種病原，例如對病毒、細菌、寄生蟲和腫瘤細胞等產生應答的一類蛋白質。本文綜述了幾種經濟魚類的干擾素基因及重組魚類干擾素的研究進展。

關鍵詞：經濟魚類；干擾素基因；重組干擾素

干擾素（Interferon，IFN）是一類能夠誘導細胞產生抗病毒狀態的細胞因子，它不直接參與抗病毒的生物學過程，而是通過產生靶基因下游的效應基因來調控病毒的感染，具有多效能、低分子量、分泌型等特點。干擾素最初是由Issacs等人在雞胚絨毛尿囊膜細胞的病毒干擾實驗中被發現。不同物種間干擾素的基因結構和亞基組成具有較大的差異，根據干擾素與受體結合的方式和其與抗體結合的抗原性不同可分為三類：工型干擾素主要包括α和β，Ⅱ型干擾素只有一個成員為γ型干擾素和Ⅲ型干擾素入。干擾素作為機體最重要的細胞因子之一，主要生物學功能體現為廣譜的抗病毒活性和免疫調節能力。根據人和哺乳動物的相關研究，干擾素對病毒防御的主要方式是通過轉導信號和激活相關轉錄，導致下游基因受干擾素的表達調控，生成多種調控因子直接作用于入侵的病毒，保護機體免受感染。

斑馬魚（Danio rerio）、大西洋鮭魚（Salmosalar）和斑點綠河純（Tetraodon nigroviridis）等魚類的干擾素基因于2003年被克隆到，之后，許多其他的硬骨魚的干擾素基因被克隆和鑒定。魚類的干擾素可以分為兩類：Ⅰ型、Ⅱ型（IFN-γ）。工型是最早被發現的IFN家族成員，能夠調節多種免疫細胞的發育和分化、誘導表達以及細胞凋亡和抑制腫瘤基因誘導的轉化。與鳥類和哺乳動物的工型干擾素基因結構不同的是，魚類工型基因包含5個外顯子和4個內含子，而鳥類和哺乳動物的Ⅰ型干擾素基因不含內含子。在哺乳動物中，Ⅱ型干擾素也叫做IFN-γ，是由一個獨立基因編碼的，該基因含有4個外顯子和3個內含子。Ⅱ型干擾素是一種典型的Th1細胞因子，主要由CD4+Th1細胞和NK細胞產生，能夠激活Th1的反應和活化巨噬細胞。魚類的Ⅱ型干擾素與哺乳動物的Ⅱ型干擾素同源，許多魚類擁有兩種Ⅱ型干擾素（IFN-γ和IFN-γ2）。

魚類是水產養殖中重要的經濟物種，隨著其規模化、工廠化的高密度養殖，其病害時有爆發，這嚴重制約了魚類養殖業的可持續健康發展，給養殖生產者造成了巨大的經濟損失。在魚類養殖過程中，除加強綜合管理外，還要針對不同魚的品種的特定疾病采取預防和治療措施，但效果甚微。為達到預防病原菌和病毒的目的，提高魚類自身免疫能力對于增強其抗病力至關重要。因干擾素的生物學作用，科研工作者已將部分魚類的干擾素基因通過基因工程技術制備重組魚類干擾素，為今后取代抗生素或化學藥物在魚類病害防治上的應用提供了參考。下面，簡要介紹幾種經濟魚類的干擾素及其干擾素基因的重組表達情況。

1 草魚的干擾素及其基因的重組表達與應用

草魚是我國重要的淡水經濟魚類，主要以混養為主，但養殖過程中出現的“四病”及病原微生物對草魚產量及質量造成一定的損失。很多學者致力于提高草魚免疫力的研究。起初，研究者將人α-干擾素（hu-IFN-α）基因序列轉入到草魚基因組內，成功獲得表達人α-干擾素蛋白的轉基因草魚，通過一段時間的養殖發現，轉基因草魚的抗病能力較普通草魚的抗病能力高；后續實驗證明轉植基因能夠遺傳給后代，且雌核發育陽性率高，但在遺傳過程中受外界或者遺傳因素的影響會有部分丟失。

草魚的干擾素及相關基因研究較為廣泛，主要分為以下幾類：

Ⅰ型干擾素：MTT法（MTT assay）測定原核表達并經純化后的重組草魚Ⅰ型干擾素（rCi-IFN）對草魚腎細胞系CIK細胞的抗草魚出血病毒（Gras Carp Hemorrhage Virus，GCHV），結果顯示rCiIFN的生物活性與其濃度呈正相關關系。后續通過注射實驗檢測到重組rCiIFN蛋白能夠上調干擾素相關基因IFN、IRF-1、IRF-7、STAT-3、MX、PKR的表達，且效果較聚肌胞苷酸（polyinosinic-polycytidylic acid，polyI：C）的誘導效果好。目前，草魚rCiIFN已被大量發酵，并找到最佳給藥方式，且將草魚rCiIFN蛋白摻入飼料中可有效提高草魚幼魚成活率。工型干擾素是多基因家族，主要包括IFNa、β等10余種亞型，最主要且研究最多的應屬IFNa、β兩種基因。草魚IFNa已被成功擴增出目的序列并獲得高純度rCiIFNa蛋白，抗病毒實驗證明其具有生物學活性，且對于魚類細胞系抗病毒效果良好。

干擾素γ：草魚干擾素γ也稱為干擾素-rel（IFN-rel），利用同源克隆并結合RACE的方法成功獲得草魚IFN72的cDNA全長序列。已構建pET30a（+）-IFN-rel重組表達載體，轉化至大腸桿菌胞內成功獲得高純度的重組草魚IFNγ2蛋白。以重組IFN-rel蛋白刺激草魚頭腎細胞，能有效促進脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）誘導IL-1β mRNA表達水平。同時，將構建的真核表達載體pcDNA3.1-myc-his轉染至HEK293細胞內，會使草魚頭腎細胞中IL8的基因表達上調。

2 鯉魚的干擾素基因

鯉魚的干擾素基因的研究與草魚相比較為緩慢，陳義龍等通過PCR獲得了鯉魚干擾素γ-2β的全長序列。序列分析表明，鯉魚干擾素基因具有較高的保守性，剪接點之間嚴格遵守GT-AG規則，對于其表達與應用還需要進一步研究。鯉魚干擾素調節因子的研究相對較成熟，通過RACE技術克隆得到IRF1、IRF5基因的cDNA序列，實驗證明，鯉魚的IRF1、IRF5雖具有不同的表達模式，但都可能在抗病毒過程中發揮作用。韋信賢等人，構建過表達載體鯉魚Toll樣受體2（CcTLR2），同時轉染到鯉魚上皮瘤，結果發現TLR2可以使干擾素調節因子上調并抑制病毒的增殖。

3 黑青斑河純和紅鰭東方純的重組干擾素

黑青斑河純干擾素IFNγ1、IFNγ2兩種基因均得到了克隆，現已證明黑青斑河純IFNγ1與IFNγ2表達模式存在較大差異。構建高效表達載體，原核表達黑青斑河純重組IFNγ1蛋白，并以不同濃度重組蛋白刺激頭腎細胞，結果表明純化得到的重組蛋白具有生物學活性，且能夠刺激細胞增殖。

馬普等（2015）提取紅鰭東方純腎臟組織的總RNA，進行RT-PCR擴增得到干擾素γ（IFNγ）基因序列。將紅鰭東方純IFN7成熟肽序列與表達載體PET-32a（+）相連，構建了重組表達載體pET-32a-IFN7。將其成功轉化入E.coli BL21（DE3）感受態細胞，經IPTG誘導，pET-32a-IFN7在BL21中得到了融合表達。進行表達產物的純化和Western Blotting檢測，結果顯示紅鰭東方純IFNγ基因在大腸桿菌中的表達量較高，獲得目的蛋白準確。該研究為后續紅鰭東方純重組干擾素γ活性驗證及應用奠定了基礎。

4 半滑舌鰨和大菱鲆的干擾素

半滑舌鰨干擾素的研究主要體現在其相關基因功能的研究與應用上。龍昊從半滑舌鰨cD-NA文庫中克隆得到IFIT家族中的一個基因CsIFIT1，生物學軟件分析其結構，qRT-PCR實驗分析CsIFIT1在免疫相關的器官組織中的表達情況。研究發現在半滑舌鰨中通過過量表達CsIFIT1可顯著抑制腫大細胞病毒在魚體中的復制，當降低CsIFIT1表達后，病毒在組織中的復制量明顯增高。也有研究表明半滑舌鰨ISG15在病毒感染實驗中也發揮著類似的抗病毒作用，猜測其可能通過調節干擾素相關免疫因子間接發揮抗病毒作用。

林婧赟采用同源克隆及RACE技術克隆得到大菱鲆干擾素刺激基因15（ISG15）。結構分析表明其包含兩個類泛素結構域，C末端含有一個保守的RLRGG基序。表達分析ISG15在大菱鲆12個組織（包括腦、鰓、胃、腸等）呈組成型表達，且在頭腎、體腎、脾等免疫相關組織中的表達量較高。大菱鲆受到poly I：C和TRBIV刺激后，ISG15基因在鰓、脾、頭腎和肌肉中表達上調，這為ISG15在抗病毒免疫中發揮作用的途徑提供了證據。

5 牙鲆的重組干擾素

牙鲆（Paralichthys olivaceus）同樣有以上兩種Ⅱ型干擾素的轉錄本，但這兩個轉錄本極為相似，僅有三個核苷酸不同。目前，采用同源PCR和cDNA末端技術快速擴增褐牙鲆脾組織IRF5基因全長的cDNA（1869 bp）和DNA（3655bp，含9個外顯子和8個內含子），其mRNA在鰓和頭腎組織中表達水平較高，在腦、肝和皮膚中表達水平較低，揭示了該基因屬于硬骨魚IRF5亞群。同時利用干擾素誘導劑（Poly I：C）刺激IRF5基因導致了其晚而持久的上調，表明了該基因很有可能是一種干擾素刺激基因（ISG）。在牙鲆養殖中，愛德華氏病是一種常見的細菌性疾病，注射重組的Ⅱ型干擾素可以很大地提高其生存率。這表明重組的牙鲆Ⅱ型干擾素能夠增強牙鲆免疫應答和抵抗愛德華氏菌的感染。

6 虹鱒和大西洋鮭的干擾素

Robertsen等確定并克隆大西洋鮭體內兩種Ⅰ型IFN（SasaIFN-a1、SasaIFN-a2），SasaIFN-a1基因cDNA序列感染人胚腎293細胞系產生了高生物學活性，使大西洋鮭細胞系免受IPNV病毒感染，同時誘導了Mx基因的表達。

Jun Zou等根據虹鱒與大西洋鮭基因組的高等同源性，從虹鱒頭腎細胞的cDNA文庫中篩選出虹鱒的IFN-γ基因，并對其生物活性進行試驗分析：兩種基因混合免疫可增強虹鱒機體免疫力。閆春梅等將構建有熒光標記的兩種重組真核表達質粒（鯉魚IL-1β及IFN基因序列）混合免疫待產虹鱒親本并在受精過程中進行二次免疫，免疫熒光檢測證明兩種重組質粒表達良好，虹鱒幼魚成活率較對照組高。劉敏對赤眼鱒Mx基因全長進行克隆、表達及重組載體構建，得到其在各組織的表達情況。含有IFN基因序列的真核載體pCR3.1轉染至HEK293細胞內，經培養后細胞表達重組大西洋鮭干擾素能夠抵抗傳染性胰壞死病毒（IPNV）以保護大西洋鮭頭腎TO細胞。

7 尼羅羅非魚、斑點叉尾鮰和斜帶石斑魚的干擾素基因

吳芳等人克隆了尼羅羅非魚γ-干擾素基因，發現該基因的cDNA大小為690 bp，生物信息學分析推測編碼206個氨基酸。qPCR檢測發現正常尼羅羅非魚個體γ-干擾素基因在不同組織中均有表達，且在脾臟中表達量最高，其次是腸、鰓和腎臟，在皮膚、心臟和肌肉組織中的表達量則較低，推測尼羅羅非魚γ-干擾素參與魚體對病原菌的防御過程，在免疫反應中發揮重要作用。

斑點叉尾鮰（channel catfish）能夠產生兩種Ⅱ型干擾素的mRNAs（IFN-γ1和IFN-γ2），這兩個mRNA在不同的組織和細胞類型中表達形式不同。研究表明，克隆出斑點叉尾鮰的IFN-α基因，其開放閱讀框由492個核苷酸組成，推測其編碼產物由164個氨基酸組成。經核酸序列分析比對后發現，就干擾素γ而言，斑點叉尾鮰與鯰魚的親緣關系較近。此外，還有研究發現與其他魚類重組克隆不同的是斑點叉尾鮰的IFN似乎缺少第一個成熟的氨基酸和信號序列。

黃貝等人已克隆出斜帶石斑魚的IFNγcDNA序列，并通過感染polyI：C分析其IFNγ組織表達情況，進而推測IFNγ機體在抗病毒感染過程中發揮作用。對于干擾素的作用機理研究較少，但有人發現干擾素下游基因Toll樣受體通過依賴MyD88，或TRIF通路傳導信號，從而誘導轉錄因子NF-kB和IRF的表達，啟動機體非特異性免疫和獲得性免疫而抵御病原入侵。

8 結語

隨著魚類養殖規模的不斷擴大、品種的不斷增加，養殖過程中病害問題也日益嚴重。因此，養殖過程中開始出現抗生素濫用的情況，不僅會造成魚類產生抗藥性，還會使魚類自身免疫系統受到損害，同時也會引起環境的二次污染。目前，在魚類干擾素相關基因的克隆和調控等方面的研究已取得了重要的進展，為重組魚類干擾素在魚類病害防治上的開發和利用奠定了基礎。

（收稿日期：2016-06-15）