毛冬青基因組DNA提取方法及ISSR-PCR反應體系的優化△

付銓盛，衛瀅，席秀麗，黃海波

(廣州中醫藥大學 中藥學院，廣東 廣州 510006)

·基礎研究·

毛冬青基因組DNA提取方法及ISSR-PCR反應體系的優化△

付銓盛，衛瀅，席秀麗，黃海波*

(廣州中醫藥大學 中藥學院，廣東 廣州 510006)

目的：優化毛冬青基因組DNA提取方法，建立穩定性高、重現性好、適合其遺傳差異分析的ISSR-PCR反應體系。方法：對比CTAB法、mCTAB法、SDS法、蛋白酶K法及植物基因組提取試劑盒的提取效果后，選擇mCTAB法結合蛋白酶K法提取毛冬青基因組DNA，并優化了蛋白酶K用量。利用正交試驗設計，對毛冬青ISSR-PCR反應的5個因素(Mg2+、dNTPs、Primer、DNA、Taq酶)進行優化，PCR結果使用SPSS16.0軟件進行分析，基于優化后體系對哥倫比亞大學公布的100條ISSR引物進行篩選，確定退火溫度。結果：采用蛋白酶K-mCTAB法實現了4 h內提取高純度毛冬青基因組DNA，蛋白酶K用量為20 ng·mL-1時DNA平均提取量較傳統CTAB法提升9.5倍；毛冬青ISSR-PCR最終反應體系為Mg2+2.5 mmol·L-1，dNTPs 0.15 mmol·L-1，Primer 0.4 μmol·L-1，DNA 70 ng，Taq酶0.5 U。實驗從100條引物中篩選出16條引物并確定退火溫度，繪制出毛冬青ISSR指紋圖譜。結論：蛋白酶K-mCTAB法適合毛冬青基因組DNA的提取，篩選出的反應體系、引物及退火溫度能夠滿足毛冬青ISSR-PCR實驗的要求。

毛冬青；DNA提取；反應體系優化；引物篩選

中藥毛冬青是冬青科(Aquifoliaceae)冬青屬植物毛冬青IlexpubescensHook.et Arn.的干燥根。藥理研究顯示，其具有抗菌[1]、舒緩氣管平滑肌[2]、抑制血小板聚集[3]、擴張冠脈等作用，主要用于治療冠心病、心絞痛及脈管炎等疾病，療效確切，已有多種以毛冬青為主藥的方劑收載于衛生部部頒標準中。

近年來毛冬青的研究主要集中于植物化學[4]和藥理學方面[5]；分子生物學方面研究較少，主要集中在基于ITS序列的分子鑒別方向[6]。為加深對毛冬青種質資源多樣性、系統發育研究，本研究將優化其DNA提取方法及ISSR-PCR反應體系，并嘗試構建毛冬青的ISSR指紋圖譜。

1 材料

1.1 材料及處理

實驗材料采自廣東省梅州市平遠縣，經廣州中醫藥大學中藥鑒定教研室黃海波副教授鑒定為冬青科(Aquifoliaceae)冬青屬植物毛冬青IlexpubescensHook.et Arn.。材料選取新鮮幼嫩毛冬青葉片，用70%乙醇水溶液清潔表面后迅速置于放有變色硅膠的塑封袋中快速干燥備用。

1.2 儀器和試劑

OSE-Y20電動研磨杵(天根生化科技有限公司)、T100 PCR儀(Bio-Rad)、Powerpac Basic電泳儀(Bio-Rad )、OSE-260核酸蛋白分析儀(天根生化科技有限公司)、Tanon-2500凝膠成像系統(上海天能科技有限公司)。

dNTPs、Ex TaqDNA聚合酶、Mg2+、10x Ex Taq Buffer、Marker、蛋白酶K、RNase(Takara公司)，聚乙烯比咯烷酮(PVP)、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、β-巰基乙醇(Sigma公司)，植物基因組提取試劑盒(天根生化科技)，其余為國產分析純試劑；引物根據哥倫比亞大學提供的ISSR引物序列由北京六合華大基因科技有限公司合成。

2 方法

2.1 DNA提取及純化

實驗對比CTAB法[7]、mCTAB法[8]、SDS法[9]、蛋白酶K法[10]、植物基因組提取試劑盒5種提取方法后，選擇mCTAB法結合蛋白酶K法作為最終方法進行提取。

2.1.1 緩沖液配制 緩沖液A由100 mmol·L-1Tris-HCl (pH 8.0)、5 mmol·L-1EDTA-Na2、0.25 mmol·L-1NaCl組成，使用前加入20 mg·mL-1PVP-40T。緩沖液B由100 mmol·L-1Tris-HCl(pH 8.0)、25 mmol·L-1EDTA-Na2、1.4 mmol·L-1NaCl、40 mg·mL-1CTAB、10 mg·mL-1抗環血酸組成，使用前加入20 mg·mL-1PVP-40T、10 mg·mL-1Na2B4O7·10H2O 、0.4%β-巰基乙醇。

2.1.2 提取方法 取40 mg去主脈干燥葉片，用電動研磨杵加適量液氮研磨15 s；加入1 mL的緩沖液A冰浴10 min，期間顛倒混勻數次；12 000 r·min-1(13 400×g)離心5 min棄上清液；重復加入緩沖液A至上清液黏稠度下降；加入1 mL 緩沖液B、20 μL(20 mg·mL-1)蛋白酶 K，65 ℃水浴30 min，每10 min顛倒混勻1次；待樣品冷卻至室溫，12 000 r·min-1(13 400×g)離心5 min；取上清液，加入等體積苯酚-三氯甲烷-異戊醇(25∶24∶1)，緩慢顛倒混勻10 min使兩者充分混合均勻，12 000 r·min-1(13 400×g)離心5 min，取上清液；重復加入苯酚-三氯甲烷-異戊醇(25∶24∶1)至上層液體澄清；取上清液加入等體積三氯甲烷-異戊醇(24∶1)，緩慢顛倒混勻10 min，12 000 r·min-1(13 400×g)離心5 min；取上清液加入100 μL 3 mol·L-1NaAc及等體積預冷異丙醇，輕輕混勻，-20 ℃保存30 min；12 000 r·min-1(13 400×g)離心5 min，棄上清液；加入0.1 mL 100 mg·L-1RNase，37 ℃消化30 min；加入0.1 mL去離子水、0.1 mL 5 mol·L-1NaCl，0.8 mL預冷95%乙醇，輕輕混勻，12 000 r·min-1(13 400×g)離心5 min，棄上清液；加入0.5 mL 90%乙醇，輕輕彈起沉淀，12 000 r·min-1(13 400×g)離心2 min，棄上清液，重復本步驟1次；無菌環境敞開EP管口揮干乙醇，加入0.1 mL TE溶解DNA過夜。樣品經1%瓊脂糖凝膠電泳，選擇無拖尾、帶形清晰的樣品用核酸蛋白儀檢測濃度，統一稀釋至50 ng·μL-1，供后續實驗用。

2.2 單因素考察蛋白酶K用量

實驗采用單因素考察的方式對蛋白酶K使用量進行考察，設置5、10、15、20 μL·mL-14個水平，每個水平設置2個重復。

2.3 正交設計優化PCR反應體系

針對影響PCR反應的Mg2+、dNTPs、Taq酶、引物和模板等的濃度5個因素，以預試驗優化過的UBC807為實驗引物，選用L16(45)正交表，在4個濃度水平上進行試驗，正交設計見表3。

表3 毛冬青PCR反應體系優化正交設計表

正交試驗共16組，每組設2個重復，合計32個反應。PCR反應體系為20 μL，擴增程序為94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35次循環，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。產物在2%瓊脂糖凝膠上電泳，電泳條件為80 V 15 min，100 V 30 min，結果經凝膠成像系統拍照分析。

2.4 引物篩選及退火溫度優化

采用優化后反應體系對哥倫比亞大學公布的100條ISSR引物在其TM值上2 ℃進行篩選，選擇條帶數量多、間距合適、基本清晰的引物進行退火溫度優化。使用T100 PCR儀在50～56 ℃自動生成8個溫度梯度，選擇50.0、51.1、52.3、53.7、54.8、56.0 ℃進行退火溫度篩選。

3 結果與分析

3.1 不同提取方法DNA提取結果

5種方法提取的DNA在TGem 超微量分光光度計上檢測結果如表4所示，高純度DNA的A260/A280的值為1.7～1.9，若吸光度小于1.7則可能存在蛋白污染，大于2.0則DNA已降解或存在RNA殘留。實驗結果顯示：采用CTAB法、mCTAB法、SDS法提取的組DNA的A260/A280均小于1.7，可能存在蛋白污染；mCTAB法平均提取量較CTAB法提升79%；蛋白酶K法處理的樣品在質量和提取量上均有提升；植物基因組提取試劑盒采用硅基質膜吸附柱法對樣品進行提取，特異性吸附DNA，故提取物純度較高，但由于其成本高、柱容量有限，難以滿足后續實驗的要求，故選擇mCTAB法結合蛋白酶K法進行提取。

3.2 不同劑量蛋白酶K對提取效果的影響

經蛋白酶K處理后，獲得的毛冬青組DNA純度高、完整型好，提取量隨蛋白酶K使用量的增加而增加。在20 μL·mL-1水平下能夠獲得較高的提取量，綜合考慮實驗成本及實際需求，不建議繼續增加蛋白酶K使用量。見表5、圖1。

表4 不同方法提取毛冬青組cDNA結果(n=3)

注：*表示蛋白酶K使用量為10 μL·mL-1。

表5 蛋白酶K用量對毛冬青組DNA提取效果的影響(n=2)

圖1 蛋白酶K-mCTAB法提取毛冬青組DNA電泳結果

3.3 ISSR-PCR反應體系的正交設計結果分析

使用引物UBC807進行反應體系優化的PCR產物電泳結果見圖2，參考何正文等[11]的方法對擴增結果多態性進行評分：條帶數量豐富、穩定、清晰的計15分，涂布帶或無條帶計1分，得分越高的反應體系擴增效果越好，反應1～16的平均計分依次為：3、11、15、13、4、7、12、14、4、8、9、12、4、1、3、10。依照參考文獻計算，最終反應體系為Mg2+：2.5 mmol·L-1，dNTPs：0.15 mmol·L-1，Primer：0.4 μmol·L-1，DNA：70 ng，Taq酶：0.5 U。

注：A膠、B膠分別為反應體系正交試驗兩組重復。圖2 反應體系正交試驗電泳結果

3.4 引物、退火溫度篩選

退火溫度與引物、反應體系、模板種類等因素存在較大關系，溫度過低會引發引物與模板錯配，產生非特異性擴增，使條帶模糊甚至拖帶，退火溫度過高則會抑制引物與模板的結合，導致擴增條帶減少。本實驗從初篩后有清晰條帶的32條引物中優選出16條引物，對其退火溫度進行進一步篩選，部分篩選結果見圖3，最終引物及退火溫度見表6。

圖3 UBC813、814退火溫度篩選結果

表6 毛冬青ISSR最終引物及退火溫度

3.5 毛冬青ISSR指紋圖譜的建立

最終引物的電泳結果使用Quantity One(Bio-red co.)軟件進行處理，對帶型好、辨析度高的序列排隊及編號后，將電泳結果圖轉換為1/0原始矩陣，有條帶記為“1”，無條帶記為“0”，并根據該矩陣繪制毛冬青ISSR指紋圖譜，見圖4。

圖4 毛冬青ISSR指紋圖譜

4 討論

完整度高、純度高的DNA是ISSR-PCR準確可靠、重現性好的基本保障。毛冬青葉片內含有多糖、蛋白質、酸性及酚性皂苷類成分[12]，蛋白質及多糖容易與DNA形成復合物，使DNA溶解度降低，同時抑制Taq酶活性影響PCR擴增[13]；酚類與多酚氧化酶結合后極易氧化，在完整的細胞結構中二者被細胞膜分隔，因此較為穩定，當細胞破壁后，兩者結合發生氧化反應影響DNA的質量[14]。

本實驗結合mCTAB和蛋白酶K法對毛冬青基因組DNA進行提取，CTAB free的緩沖液A可去除大部分次生代謝產物，降低提取液黏稠程度，緩沖液B中的抗壞血酸、PVP、β-巰基乙醇和硼砂4種抑制因子共同作用，有效防止DNA的褐變；蛋白酶K的加入在減少DNase和RNase的同時有效地消化植物組織中與DNA結合的以及提取過程中與DNA形成共沉淀的蛋白質，使DNA游離于上清液中；結合苯酚-三氯甲烷-異戊醇(25∶24∶1)兩次抽提，進一步減少了蛋白質和多糖的污染。本方法實現了4 h內獲得高純度、高濃度的毛冬青基因組DNA，為后續實驗提供了保障。

近年來，利用分子標記技術對物種進行快速鑒定的技術發展迅速，其高分辨率能夠提高檢測效率、并降低成本，是未來鑒定的發展趨勢。ISSR引物開發費用降低，與RAPD和RFLP相比，ISSR在獲得數倍于RAPD信息量的同時其精確度幾乎可以與RFLP相媲美。本研究采用正交設計法優化了毛冬青ISSR-PCR反應體系，從100條引物中篩選出16條背景清晰、帶強高、重疊少的引物，其中，最多可擴增出15個條帶，最少6個條帶，16條引物合計擴增條帶163條，平均每個引物擴增出10.2條。嘗試建立了毛冬青的ISSR指紋圖譜，為后期種質資源的遺傳多樣性、系統發育研究、基因標記、基因組作圖和物種進化等方面的研究奠定基礎，從分子角度規范毛冬青植物基原，并為冬青科其他物種的研究提供參考。

[1] 宋媛媛，李媛，張洪泉.毛冬青抗炎免疫藥理作用的研究進展[J].安徽醫藥，2009，13(10)：1157-1159.

[2] 付曉春，王金輝，陳建軍，等.毛冬青有效部位對犬實驗性心肌梗死的保護作用[J].中西醫結合心腦血管病雜志，2009，7(12)：1432-1434.

[3] 熊天琴，廖嘉儀，龐龍，等.毛冬青總提取物對血栓形成及微循環的實驗研究[J].瀘州醫學院學報，2013，36(3)：216-219.

[4] 姜一平，李華，潘學智，等.毛冬青根的化學成分[J].中藥材，2013，36(11)：1774-1778.

[5] 郝巨祥，楊崇真.毛冬青的藥理作用及臨床應用研究進展[J].黑龍江醫藥，2010，23(4)：592-594.

[6] 易帆，韓鳳鳴，彭勇.15種常見冬青屬藥用植物的分子鑒別[J].中藥材，2014，37(6)：974-976.

[7] 王關林，方宏筠.植物基因工程[M].2版 北京：科學出版社，2002：742-744.

[8] 李金璐，王碩，于婧，等.一種改良的植物DNA提取方法[J].植物學報，2013，48(1)：72-78.

[9] Dellaporta S L，Wood J，Hicks J B.A plant DNA minipreparation：Version II[J].Plant Molecular Biology Reporter.1983，1(4)：19-21.

[10] 朱旭芬.基因工程實驗指導[M].北京：高等教育出版社，2006：18-25

[11] 何正文，劉運生，陳立華，等.正交設計直觀分析法優化PCR條件[J].湖南醫科大學學報，1998，23(4)：403-404.

[12] 周淵，周思祥，姜勇，等.毛冬青葉的化學成分研究[J].中草藥，2012，43(8)：1479-1483.

[13] Wang D H，Song K M，Carol K，et al.A high-throughput system for the rapid extraction of plant genomic DNA for genome mapping and marker-assisted breeding studies[J].Journal of the Association for Laboratory Automation，2005，10(4)：242-245.

[14] Nikoloudakis N，Banilas G，Gazis F，et al.Discrimination and genetic diversity among cultivated olive of Greece using RAPD markers[J].J.Amer.Soc.Hort.Sci.2003，128(5)：741-746.

OptimizationofGenomicDNAExtractMethodandISSR-PCRReactionSystemforIlexpubescens

FUQuansheng，WEIYing，XIXiuli，HuangHaibo*

(GuangzhouUniversityofChineseMedicine，Guangzhou510006，China)

Objective：To optimize genomic DNA extract method forIlexpubescens，and establish a stable，reproducible and suitable reaction system for its ISSR analysis of genetic differences.Methods：In this study，five frequently-used methods for plant genomic DNA extraction include CTAB，mCTAB，SDS，protein K and genomic DNA kit were compared for acquiring better DNA product quality and quantity.The optimized method combined mCTAB with Protein K，and the dosage of protein K was also optimized.The ISSR-PCR amplification system of five factors(Mg2+，dNTPs，primers，Taq DNA polymerase，and DNA template)forI.pubescenswas optimized by orthogonal design，the PCR result was analyzed by SPSS 16.0.Then based on the optimal ISSR-PCR amplification system，100 primers were selected and the annealing temperature was proposed by gradient determination.Results：With protein K-mCTAB，the genomic DNA extraction fromI.pubescenscould be extracted within 4 hours with great quality，and the quantity of extracted DNA was promoted seven times compared with CTAB when Protein K dosage was 20 ng·mL-1.The optimized ISSR-PCR reaction system(20 μL)was constructed，which dosages of Mg2+，dNTPs，primer，Taq polymerase，and DNA template were 2.5 mmol·L-1，0.15 mmol·L-1，0.4 μmol·L-1，0.5 U，and 70 ng，respectively.16 primers was selected and its annealing temperature was proposed.Conclusion：Proteinase K-mCTAB is suitable for genomic DNA extraction ofI.pubescens，the reaction system，primers and its annealing temperature is stable，reproducible，and suitable for its ISSR-PCR analysis

Ilexpubescens；DNA extraction；Reaction system optimization；primer screening

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.4.005

2015-12-21)

國家科技支撐計劃(2012BAI29B09)；公益性行業科研專項(201407002)

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黃海波，副教授，碩士生導師，研究方向：中藥品種鑒定與質量評價；Tel：(020)39358286，E-mail：2865055919@qq.com