基于GC指紋圖譜及聚類分析評(píng)價(jià)黔瓊產(chǎn)艾納香質(zhì)量△

孫懂華，張影波，龐玉新，楊全，于福來(lái)，黃梅

(1.廣東藥學(xué)院 中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所，海南 儋州 571737；3.海南省艾納香工程研究中心，海南 儋州 571737)

·基礎(chǔ)研究·

基于GC指紋圖譜及聚類分析評(píng)價(jià)黔瓊產(chǎn)艾納香質(zhì)量△

孫懂華1，2，3，張影波2，3，龐玉新2，3，楊全2*，于福來(lái)2，3，黃梅2，3

(1.廣東藥學(xué)院 中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所，海南 儋州 571737；3.海南省艾納香工程研究中心，海南 儋州 571737)

目的：基于指紋圖譜與系統(tǒng)聚類分析方法對(duì)黔瓊產(chǎn)艾納香進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。方法：利用氣相色譜法(GC)建立12個(gè)不同產(chǎn)地艾納香的指紋圖譜，采用相似度評(píng)價(jià)軟件及 SPSS 16.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，對(duì)貴州和海南產(chǎn)地的艾納香樣品進(jìn)行分析。結(jié)果：對(duì)12個(gè)產(chǎn)地的艾納香進(jìn)行了分析，建立了艾納香藥材氣相色譜指紋圖譜。S2、S6、S7的相似度在0.900以下，S3、S8、S10、S12的相似度在0.923～0.969，其他樣品的相似度在0.970以上；12批樣品可大致分為4類。結(jié)論：建立了艾納香氣相指紋圖譜方法，該方法重復(fù)性好、簡(jiǎn)單、易行，可為艾納香整體質(zhì)量評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

艾納香；氣相色譜指紋圖譜；聚類分析

艾納香Blumeabalsamifera(Linn.)DC，又稱大風(fēng)艾、大艾、冰片艾等，是菊科艾納香屬多年生草本植物，生長(zhǎng)在熱帶、亞熱帶，耐旱喜溫不耐寒，主產(chǎn)于我國(guó)貴州、海南、廣西、廣東、云南等地，是貴州羅甸縣道地藥材[1]。艾納香以根、嫩枝、葉入藥，其性味辛、微苦、微溫，具有祛風(fēng)消腫、活血散瘀之功效，可用于治療感冒、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、產(chǎn)后風(fēng)痛、痛經(jīng)，外用跌打損傷、瘡癤痛腫、濕疹、皮炎[2]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，艾納香還具有抗氧化、抗癌和抗病毒等作用[3-5]。

艾納香是制得艾片的原料，艾片是將艾納香葉和嫩枝經(jīng)過(guò)蒸餾設(shè)備進(jìn)行蒸餾，制得艾粉，然后再純化，但其得率較低[6]。而目前，我國(guó)天然冰片(艾片和天然冰片)市場(chǎng)供不應(yīng)求，價(jià)格居高不下。近年來(lái)，貴州羅甸地區(qū)大面積種植艾納香，使得該地區(qū)的土地資源匱乏問(wèn)題更加凸顯。為此，迫切需要拓寬艾納香藥材種植區(qū)，以滿足日益擴(kuò)大的市場(chǎng)需求。

目前對(duì)艾納香藥材的研究多集中在化學(xué)成分[7-12]及其資源種群分布[13-14]上，罕有報(bào)道其藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，僅有夏稷子等以貴產(chǎn)艾納香為主要研究對(duì)象進(jìn)行了GC指紋圖譜研究、薄層色譜法定性研究、常規(guī)檢查等[15-16]，未見(jiàn)涉及海南和貴州產(chǎn)區(qū)艾納香指紋圖譜研究的報(bào)道。基于此，為進(jìn)一步合理開(kāi)發(fā)艾納香藥材資源并緩解艾納香原料供需矛盾，作者對(duì)12批采自貴州和海南的艾納香藥材進(jìn)行了指紋圖譜比較研究，以期為艾納香藥材在貴州道地產(chǎn)區(qū)外的海南廣泛種植提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 7890A 氣相色譜儀(配有氫火焰離子化檢測(cè)器FID)，OpenLAB CDS工作站，G4513A 自動(dòng)進(jìn)樣器。電子天平(Sartorius公司)，KQ-500DB 型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 材料

左旋龍腦對(duì)照品(Alfa Aesar公司，批號(hào)：10147015，純度≥98%，)；試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，水為蒸餾水。艾納香采自海南、貴州，均由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所龐玉新副研究員鑒定為菊科艾納香屬植物艾納香Blumeabalsamifera(L.)DC.的地上葉部位。樣品信息見(jiàn)表1。

表1 艾納香樣品來(lái)源

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

其次，引導(dǎo)學(xué)員制定相關(guān)的閱讀計(jì)劃，建立讀書(shū)會(huì)，鼓勵(lì)學(xué)員分享閱讀感受。舉例而言，西點(diǎn)軍校就設(shè)立有教務(wù)長(zhǎng)讀書(shū)俱樂(lè)部，目的是匯集不同的觀點(diǎn)。教務(wù)長(zhǎng)和學(xué)員一同讀書(shū)。學(xué)員在讀完一本書(shū)之后還要進(jìn)行讀書(shū)匯報(bào)。通過(guò)設(shè)立教務(wù)長(zhǎng)讀書(shū)俱樂(lè)部，西點(diǎn)軍校引導(dǎo)其學(xué)員不斷讀書(shū)，不斷讀好書(shū)，為每位學(xué)員提供了分享看法與觀點(diǎn)的平臺(tái)。我們可以效仿西點(diǎn)軍校的做法，成立世界軍事名著讀書(shū)俱樂(lè)部，精選世界軍事名著，引導(dǎo)學(xué)員同步閱讀，分享閱讀感受。

HP-5毛細(xì)管柱(30 m×0.32 mm，0.25 μm)，升溫程序40 ℃保持3 min，以5 ℃·min-1升溫至50 ℃，以4 ℃·min-1快速升溫至100 ℃，以2 ℃·min-1升溫至108 ℃，以1 ℃·min-1升溫至112 ℃，以4 ℃·min-1升溫至120 ℃，以6 ℃·min-1升溫至180 ℃，保持6 min，以5 ℃·min-1升溫至220 ℃，保持10 min；FID檢測(cè)器溫度：240 ℃，進(jìn)樣口溫度：240 ℃；載氣：高純氮?dú)猓魉伲?.5 mL·min-1；不分流，進(jìn)樣量：0.6 μL。

2.2 對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備

取左旋龍腦對(duì)照品約10 mg，精密稱定，置10 mL棕色容量瓶中，加乙酸乙酯定容，搖勻，即得質(zhì)量濃度為1.012 mg·mL-1的左旋龍腦對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取艾納香供試品約2 g，精密稱定，置于10 mL具塞三角瓶中，加入乙酸乙酯10 mL，稱定質(zhì)量，在頻率40 kHz、功率400 W的條件下超聲提取20 min。放冷，稱定質(zhì)量，乙酸乙酯補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 取同一供試品(樣品編號(hào)：S4)，按照2.1項(xiàng)下方法，連續(xù)進(jìn)樣6次。以左旋龍腦為參照峰，計(jì)算各共有峰相對(duì)峰面積的RSD小于1.21%，相對(duì)保留時(shí)間的RSD小于0.02%，表明儀器精密度良好，符合指紋圖譜測(cè)定要求。

2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取供試品(樣品編號(hào)：S4)，按照2.1項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，分別進(jìn)樣。以左旋龍腦為參照峰，計(jì)算各共有峰相對(duì)峰面積的RSD小于2.08%，相對(duì)保留時(shí)間的RSD小于0.05%，表明實(shí)驗(yàn)重復(fù)性良好，符合指紋圖譜測(cè)定要求。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液(樣品編號(hào)：S4)，分別于0、2、4、8、12、24 h按照2.1項(xiàng)下方法進(jìn)樣分析。以左旋龍腦為參照峰，計(jì)算各共有峰相對(duì)峰面積RSD小于1.68%，相對(duì)保留時(shí)間的RSD小于0.03%，表明供試品在24 h內(nèi)穩(wěn)定，符合指紋圖譜的要求。

2.5 樣品測(cè)定

取不同產(chǎn)地的艾納香藥材，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，分別得到12批樣品的指紋圖譜。見(jiàn)圖1。

圖1 不同產(chǎn)地艾納香藥材指紋圖譜

2.6 指紋圖譜的建立及相似度分析

以參照物峰保留時(shí)間作為1，計(jì)算其他各共有峰與參照物峰間保留時(shí)間的比值，從而得出各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間，結(jié)果見(jiàn)表2和表3。將12批艾納香色譜圖采用國(guó)家藥典委員會(huì)頒布的“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)A 版”進(jìn)行分析，以S1為參照?qǐng)D譜，采用中位數(shù)，時(shí)間窗寬度0.1，生成艾納香藥材共有模式的對(duì)照指紋圖譜，標(biāo)定21個(gè)共有峰，共有峰峰面積占總峰面積85%以上，見(jiàn)圖2。12批所測(cè)供試品色譜圖與對(duì)照指紋圖譜相似度結(jié)果見(jiàn)表4。結(jié)果表明，S2、S6和S7樣品的相似度小于0.900，其他批艾納香藥材樣品的相似度均在0.900以上。

2.7 艾納香藥材聚類分析

運(yùn)用SPSS 16.0軟件對(duì)12批艾納香藥材的指紋圖譜進(jìn)行聚類分析。其中數(shù)據(jù)源為21個(gè)共有峰的峰面積，所有數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化處理，聚類方法采用類內(nèi)平均鏈鎖及平方歐式距離，結(jié)果見(jiàn)圖3。根據(jù)樹(shù)形圖，12批樣品被劃分為4類，其中S2、S6和S7為一類，聚類分析所得到的樣品之間的相關(guān)性，與相似度計(jì)算得到的樣品之間的相關(guān)性結(jié)果較一致。

表2 12批艾納香共有峰的相對(duì)保留時(shí)間 /min

表3 12批艾納香共有峰的相對(duì)峰面積

注：4.左旋龍腦。圖2 艾納香藥材對(duì)照指紋圖譜

表4 12批艾納香色譜圖與對(duì)照指紋圖譜相似度分析結(jié)果

圖3 12批艾納香樣品聚類分析樹(shù)狀圖

3 討論

3.1 色譜條件的選擇

氣相色譜法中常常會(huì)遇到寬沸程多組分樣品難以分開(kāi)的問(wèn)題，而選擇恒定柱溫?zé)o法兼顧不同沸點(diǎn)組分的分離。低沸點(diǎn)組分由于柱溫太高，色譜峰出柱過(guò)快，峰窄而相互重疊；而高沸點(diǎn)組分因柱溫太低、出柱慢、峰寬而平，有的組分甚至不能流出。鑒于此，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了多個(gè)升溫程序和不同載氣流速，而以2.1項(xiàng)下的色譜條件所得到的色譜峰分離度較好，保留時(shí)間適中，故選擇此條件。

3.2 供試品溶液的制備

分別考察了0.5、1.0、1.5、2.0 g等不同樣品提取量，結(jié)果表明2.0 g的樣品量效果較理想并且峰形、峰數(shù)目較為穩(wěn)定。分別考察了10、20、30、60 min提取的樣品，結(jié)果表明，20 min時(shí)樣品的提取較充分且各色譜峰分離效果較好，響應(yīng)值較大。

3.3 結(jié)果分析

中藥材化學(xué)成分復(fù)雜，其內(nèi)涵活性亦常有多種成分共同起作用形成，導(dǎo)致了全面控制中藥材質(zhì)量的難度很大。中藥材的GC指紋圖譜中各色譜峰形成“指紋圖譜”的峰面積，保留時(shí)間、峰與峰間的相對(duì)比例等綜合參數(shù)構(gòu)成了指紋圖譜。

通過(guò)本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，12批黔瓊產(chǎn)艾納香中9批藥材指紋圖譜整體圖與其共有模式相比相似度均達(dá)到0.90以上，因此確定了黔瓊產(chǎn)艾納香的指紋圖譜。對(duì)艾納香藥材指紋圖譜的比較發(fā)現(xiàn)，各產(chǎn)地藥材指紋圖譜具有基本相同的色譜峰數(shù)目，各峰相對(duì)保留時(shí)間符合程度較好，但各峰之間相對(duì)峰面積的比值相差較大，這說(shuō)明艾納香藥材的各化學(xué)成分基本相同。通過(guò)對(duì)藥材產(chǎn)地、采收期等因素進(jìn)行比較可以發(fā)現(xiàn)，黔瓊產(chǎn)艾納香野生種與栽培種在相似度上未有顯著差異；從以上不同采收期艾納香藥材的相似度(高于0.90)評(píng)價(jià)可以看出，黔產(chǎn)艾納香采收期在11～12月與瓊產(chǎn)艾納香5月、9月、12月采收期相似性較高，與龐玉新等[17]研究黔瓊產(chǎn)艾納香主要成分含量分析結(jié)果相符。

研究人員[18]對(duì)羅甸艾納香生長(zhǎng)適宜氣候條件和羅甸縣的氣候條件分析比較，發(fā)現(xiàn)艾納香藥材最適宜種植區(qū)主要分布在海拔400 m以下的河谷低洼地區(qū)，年平均氣溫20.0～20.8 ℃，最冷月均溫10.3～11.0 ℃，年極端最低溫度≥-1.1 ℃的保證率為80%，日平均氣溫≥10 ℃的活動(dòng)積溫6 400.3～7000 ℃·d，無(wú)霜期≥350 d，無(wú)日均溫≤0 ℃的輕霜凍及日均溫≤-2 ℃的重霜凍，年降雨量859.8～1 176.9 mm，年總?cè)照諘r(shí)數(shù)1 227.5～1 398.8 h。與之相比，海南省屬熱帶季風(fēng)氣候，是我國(guó)最具有熱帶海洋氣候特色的地方，全年暖熱，雨量充沛，干濕季節(jié)明顯，年光照為1750～2650 h，光照率為50%～60%，光溫充足，光合潛力高，與艾納香最適宜種植氣候條件較為接近，海南島全年無(wú)霜凍，冬季溫暖，且海南產(chǎn)艾納香藥材5月、9月、12月采收與黔產(chǎn)艾納香具有極高的相似性，在此基礎(chǔ)上可對(duì)海南產(chǎn)艾納香年采收兩次提供一定的數(shù)據(jù)支撐。此外，根據(jù)相似度和聚類分析結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，貴州黎平、羅蘇、望謨等地產(chǎn)艾納香與道地產(chǎn)區(qū)羅店紅水河相似性較差，分析原因可能與當(dāng)?shù)貧夂颉⑼寥馈⒑０蔚纫蛩赜嘘P(guān)。

綜合以上分析結(jié)果及考慮當(dāng)前貴州土地資源日益匱乏的情況，海南有著面積廣闊的土地資源且符合艾納香種植氣候條件等先天優(yōu)勢(shì)，課題研究可在一定程度上為后期在海南儋州、瓊中、白沙、五指山等地建立艾納香的GAP種植基地以減緩貴州土地資源壓力提供了理論基礎(chǔ)。

[1] 中國(guó)科學(xué)院《中國(guó)植物志》編委會(huì).中國(guó)植物志：第75卷[M].北京：科學(xué)出版社，1979：13，75.

[2] 中國(guó)藥材公司.中國(guó)中藥資源志要[M].北京：科學(xué)出版社，1994：1266.

[3] Osaki N，Koyano T，Kowithayakorn T，et al.Sesquiterpenoids and Plasmin-Inhibitory Flavonoids from Blumea b alsamifera[J].Journal of natural products，2005，68(3)：447-449.

[4] Nessa F，Ismail Z，Mohamed N，et al.Free radical-scavenging activity of organic extracts and of pure flavonoids ofBlumeabalsamiferaDC leaves[J].Food Chemistry，2004，88(2)：243-252.

[5] Noor Rain A，Khozirah S，Mohd Ridzuan M A，et al.Antiplasmodial properties of some Malaysian medicinal plants[J].Trop Biomed，2007，24(1)：29-35.

[6] 江興龍，潘俊鋒，司健，等.貴州艾納香產(chǎn)地采收提取艾粉技術(shù)研究[J].生物質(zhì)化學(xué)工程，2006，40(1)：17-20.

[7] 嚴(yán)敏，石成亮，湯洪敏.氣質(zhì)聯(lián)用法對(duì)艾納香中龍腦含量的測(cè)定[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，53(21)：5256-5259.

[8] 衛(wèi)亞麗，湯洪敏，莫珊鳳，等.不同產(chǎn)地黔艾納香中左旋龍腦含量測(cè)定[J].中華中醫(yī)藥雜志，2015，30(1)：278-280.

[9] 劉進(jìn)濤，靳鳳云，章譽(yù)，等.貴州羅甸艾納香中左旋龍腦的含量測(cè)定[J].貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，35(1)：16-18.

[10] 夏稷子，陳貴，安軍，等.艾納香揮發(fā)油和左旋龍腦在不同葉型及不同部位的分布[J].中成藥，2014，36(8)：1719-1721.

[11] 嚴(yán)敏，王玉鳳，湯洪敏.黔產(chǎn)艾納香生物堿的提取及含量測(cè)定[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，53(10)：2336-2339.

[12] 王遠(yuǎn)輝，田洪蕓，何思佳，等.不同方法提取艾納香葉揮發(fā)性成分的氣相色譜-質(zhì)譜分析[J].食品工業(yè)科技，2012，33(12)：97-101，105.

[13] 胡蕖，周家維.貴州省艾納香植物資源現(xiàn)狀及適生區(qū)區(qū)劃初步研究[J].貴州林業(yè)科技，1999，27(1)：44-48.

[14] 羅夫來(lái)，王振，張?jiān)屏埽?苗藥艾納香不同居群及不同部位的質(zhì)量研究[J].中國(guó)當(dāng)代醫(yī)藥，2013，20(31)：51-53.

[15] 夏稷子，趙智，安軍，等.不同產(chǎn)地艾納香藥材的GC指紋圖譜研究[J].中國(guó)藥事，2011，25(12)：1191-1194.

[16] 夏稷子，趙智，鄧言歡，等.黔產(chǎn)艾納香藥材質(zhì)量研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2012，23(9)：2244-2245.

[17] 龐玉新，黃梅，于福來(lái)，等.黔瓊產(chǎn)艾納香中主要化學(xué)成分含量差異分析[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2014，30(4)：448-452.

[18] 劉朝英，譚清波，顧欣.羅甸縣艾納香種植氣候適宜性區(qū)劃[J].貴州氣象，2013，37(4)：38-40.

StudyonQualityEvaluationofBlumeabalsamiferafromHainanandGuizhouProvincebyGCFingerprintandClusterAnalysis

SUNDonghua1，2，3，ZHANGYingbo2，3，PANGYuxin2，3，YANGQuan1*，YUFulai2，3，HUANGMei2，3

(1.SchoolofTraditionalChinese，GuangdongPharmaceuticalUniversity，Guangzhou510006，China；2.TropicalCropsGeneticResourcesInstitute，ChineseAcademyofTropicalAgriculturalSciences，Danzhou571737，China；3.HainanProvincialEngineeringResearchCenterforBlumeaBalsamifera，Danzhou571737，China)

Objective：GC fingerprint ofBlumeabalsamiferaand the cluster analysis were used to evaluateB.balsamiferafrom Hainan and Guizhou province.Methods：The chromatographic fingerprints ofB.balsamiferafrom 12 different origins were established by GC.“Similarity Evaluation System for Chromatographic Fingerprint of TCM” and SPSS 16.0 was applied to analyzeB.balsamiferasamples from Hainan and Guizhou province.Results：12 batches ofB.balsamiferawere analyzed，the fingerprints ofB.balsamiferafrom different areas were established.The fingerprint similarity of S2，S6，S7 was 0.711 to 0.888.The fingerprint similarity of S3，S8，S10，S12 was 0.923 to 9.969，and the samples were divided into 4 clusters by their quality difference.Conclusion：This method is reproducible，simple and easy，and can be used to provide a base for the quality control ofB.balsamifera.

Blumeabalsamifera，GC fingerprint，cluster analysis

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.4.009

2015-09-21)

中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(1630032015039)；國(guó)家自然科學(xué)基金(81374065)

*

楊全，教授，研究方向：植物類藥材的規(guī)范化生產(chǎn)(GAP)、道地藥材質(zhì)量及其形成機(jī)制；Tel：(0898)23300268，E-mail：yangquan7208@vip.163.com