丁座草藥材指紋圖譜的建立及質量評價△

李宜航，宋美芳，呂婭娜，李學蘭，李光*，陳曦

(1.中國醫(yī)學科學院 藥用植物研究所 云南分所，云南 景洪 666100；2.西雙版納州傣藥南藥重點實驗室，云南 景洪 666100；3.中國醫(yī)學科學院 藥用植物研究所，北京 100193)

·基礎研究·

丁座草藥材指紋圖譜的建立及質量評價△

李宜航1，2，宋美芳1，2，呂婭娜1，2，李學蘭1，2，李光1，2*，陳曦1，3*

(1.中國醫(yī)學科學院 藥用植物研究所 云南分所，云南 景洪 666100；2.西雙版納州傣藥南藥重點實驗室，云南 景洪 666100；3.中國醫(yī)學科學院 藥用植物研究所，北京 100193)

目的：研究并建立丁座草藥材的指紋圖譜，為有效控制其質量提供可靠方法。方法：采用反相超高效液相色譜法，Purospher C18色譜柱，乙腈-0.05%磷酸溶液梯度洗脫，流速：0.8 mL·min-1，檢測波長：278 nm，并且采用“中藥指紋圖譜計算機輔助相似度評價軟件”進行了指紋圖譜相似度評價。結果：不同產地丁座草指紋圖譜相似度較好，在指紋圖譜中確定了10個共有峰，各色譜峰的分離較好，符合指紋圖譜檢測要求。結論：該指紋圖譜檢測方法重現性好，可用于丁座草藥材的質量評價。

丁座草；指紋圖譜；超高效液相色譜法

丁座草BoschniakiahimalaicaHook.f.et Thoms為列當科草蓯蓉屬植物，常寄生于杜鵑花屬植物根上；以球形塊莖入藥，具有理氣止痛、止咳祛痰、消脹健胃的功效[1]，為千草腦脈通口服液的主要組方藥物，臨床多用于治療缺血性卒中及后遺癥，療效確切[2]。目前對丁座草的質量控制，以松脂苷作為考察指標，然而對單一成分的檢測不足以說明中藥的質量，并且專屬性較差[3-4]。

丁座草的化學成分研究表明，其中主要含有三萜類和木脂素類化合物，除松脂苷外，松脂醇、落葉松脂醇、馬先蒿木脂甲素等均具備抗病毒、抗疲勞等生物活性[5-7]。中藥的藥效是內含物質群的整體作用結果，因此，建立丁座草藥材多成分質量控制方法對于藥材質量控制和臨床藥效穩(wěn)定具有重要的意義。

指紋圖譜分析可以實現多元檢測、多水平評價，是國際上公認的控制中藥、天然藥品種質量的有效方法[8]。本文使用超高效液相色譜法，研究并建立了丁座草藥材的指紋圖譜，為其質量控制提供了有效的方法。

1 儀器和材料

1.1 儀器

Waters 600超高效液相色譜儀(Waters公司)；JN-5200DT超聲清洗器(寧波市新江南儀器有限公司)；98-1-B電子調溫電熱套(天津市泰斯特儀器有校內公司)；RE-52A旋轉蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；SHZ-D循環(huán)水真空泵(河南省豫華儀器有限公司)；A135-S分析天平(梅特勒托利多公司)。

1.2 材料

乙腈、甲醇(瑞典OCEANPAK公司，批號：40203-15309、30281-27409)；(+)-松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷(松脂苷)(中國食品藥品檢定研究院，批號：MUST-14051302)；磷酸(天津市風船化學試劑科技有限公司，批號：130507)。

樣品：丁座草藥材購于云南、四川、湖北等地，經藥用植物研究所云南分所李學蘭研究員鑒定為丁座草BoschniakiahimalaicaHook.f.et Thoms的塊莖。樣品信息見表1。

表1 丁座草藥材樣品信息表

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性

色譜柱：Purospher STAR RP-18(250 mm×4.6 mm，5 μm)柱；流動相：乙腈-0.05%磷酸水(V/V)；運行時間：50 min，洗脫梯度：15∶85(0～10 min)，25∶75(10～30 min)，40∶60(30～40 min)，80∶20(40～50 min)；流速：0.8 mL·min-1；檢測波長：278 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL；理論塔板數以松脂苷計不低于4000，且與其他色譜峰分離度大于1.0。

2.2 供試品溶液制備

取干燥的丁座草藥材，粉碎后過3號篩。細粉于硅膠干燥器內干燥24 h，精密稱定0.2 g置50 mL具塞錐形瓶中，加50%甲醇20 mL，稱重，超聲20 min，稱重，補足缺失重量，0.22 μm微孔濾膜過濾，精密量取續(xù)濾液1 mL，置10 mL容量瓶中，加50%甲醇至刻度混勻。

2.3 對照品溶液制備

精密稱取松脂苷適量，置10 mL棕色容量瓶中，加入甲醇至刻度，制成0.08 mg·mL-1對照品溶液。

2.4 標準曲線的制備

精密稱取松脂苷對照品適量，置10 mL棕色容量瓶中，加甲醇并稀釋至刻度，在2.1項的色譜條件下，分別進樣1、2、4、6、8、10 μL，每個樣品連續(xù)進樣5次，以濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)，建立標準曲線，得到松脂苷對照品的回歸方程Y=23 575X-62 317.5，r=0.999 7，顯示松脂苷在0.578 8～5.788 3 μg呈現良好的線性關系。

2.5 穩(wěn)定性試驗

取松脂苷對照品(4號樣品)溶液，分別于0、2、6、12、24 h進樣，測定色譜圖，對各峰的相對保留時間、峰面積進行了對比，結果表明主要色譜峰的相對保留時間和峰面積RSD均小于1.23%，基本一致，符合指紋圖譜的要求。

2.6 精密度試驗

取松脂苷對照品溶液，連續(xù)進樣6次，測定色譜圖，比較主要峰面積和保留時間，結果6次測定色譜圖保留時間和主要峰峰面積穩(wěn)定，RSD均小于0.81%，精密度良好，符合指紋圖譜要求。

2.7 重現性試驗

取同批丁座草藥材(4號樣品)，按照上述處理方法制備供試品溶液6份，進樣測定色譜圖，對主要峰保留時間及峰面積進行比較，結果各共有峰的相對保留時間、峰面積的RSD均小于1.02%，基本一致。

2.8 特征峰與內參照峰的確定

取松脂苷對照品按2.1色譜方法進行檢測，確認其中的已知成分，并確定其保留時間為27.804 min，見圖1。

圖1 (+)-松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷超高效液相色譜圖

2.9 丁座草超高效指紋圖譜的測定

取10批不同的丁座草藥材，分別按照上述方法測定，記錄并整合色譜圖，見圖2。上述測試結果經“中藥指紋圖譜計算機輔助相似度評價軟件”處理，確定10個共有指紋特征峰，共有指紋峰的峰面積占總峰面積的90%以上，符合指紋圖譜的要求，獲得丁座草超高液相指紋圖譜，見圖3。根據保留時間，指認8號峰為松脂苷，以對照品峰面積為參照，計算共有指紋峰的相對保留時間及峰面積比值，結果見表2和表3。

圖2 10批丁座草藥材指紋圖譜

圖3 丁座草藥材的超高效液相對照指紋圖譜

表2 丁座草指紋圖譜共有峰相對保留時間/min

表3 丁座草指紋圖譜共有峰相對峰面積

2.10 指紋圖譜相似度比較與丁座草品質評價

通過中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件，以生成對照指紋圖譜為模板，對10批丁座草樣品圖譜進行相似度比較，結果見表4。10批樣品與對照指紋圖譜的相似度在0.917～0.983，以相似度作為優(yōu)質藥材的判斷標準，以云南華坪丁座草相似度最高(0.983)，松脂苷含量最高為云南洱源產丁座草。

表4 10批丁座草指紋圖譜相似度及松脂苷含量

3 討論

分別采用乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸、甲醇-0.1%甲酸、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.5%磷酸溶液系統(tǒng)進行了等度和不同線性梯度洗脫。結果表明，以乙腈-0.05%磷酸線性洗脫分離效果較好，基線漂移小，色譜峰分離度好、保留時間穩(wěn)定。

對于不同波長下的色譜圖進行分析比較，發(fā)現松脂苷參照溶液和丁座草藥材提取液在278 nm處均有最大吸收，同時當λ=278 nm時，色譜峰較多且峰形較好，因此選擇278 nm作為測定波長。

本實驗指紋圖譜反映了丁座草中主要成分的含量及多種化合物相對比例，可用于丁座草藥材的定性鑒別和質量監(jiān)控。

[1] 金銀萍，張國剛，鄭洪婷，等.丁座草的化學成分研究[J].中國藥物化學雜志，2007，17(6)：390-391.

[2] 鮑娟，談躍，徐勉，等.千草腦脈通口服液治療急性缺血性卒中90例臨床研究[J].中醫(yī)雜志，2006，47(12)：920-922.

[3] 金銀萍.丁座草化學成分和質量控制[D].沈陽：沈陽藥科大學，2007.

[4] 周自桂，金春，徐成，等.HPLC法測定千草腦脈通片中(+)-松脂素單葡萄糖苷的含量[J].中國藥師，2010，13(5)：697-698.

[5] Liu L H，Pu J X，Zhao J F，et al.A new lignan from Boschniakia himalaica[J].Chinese Chemical Letters，2004，15(1)：43-45.

[6] 陳于邀，商士斌.丁座草化學成分研究[J].植物學報，1992，34(11)：878-882.

[7] Zhang W，Luo J，Kong L.Chemical constituents from Boschniakia himalaica[J].Biochemical Systematics and Ecology，2013，49：47-50.

[8] 張鈞.指紋圖譜研究現狀的分析[J].中國醫(yī)藥導報，2007，4(27)：150-151.

EstablismentofControlFingerprintandQualityAssessmentofBoschniakiahimalaicaHook.f.etThoms

LIYihang1，2，SONGMeifang1，2，LYUYana1，2，LIXuelan1，2，LIGuang1，2*，CHENXi1，3*

(1.YunnanBranchInstituteofMedicinalPlant，ChineseAcademyofMedicalSciences，Jinghong666100，China；2.KeylaboratoryofDaiandSouthernmedicineofXishuangbannaDaiautonomousprefecture，Jinghong666100，China；3.InstituteofMedicinalPlant，ChineseAcademyofMedicalSciences，Beijing100193，China)

Objective：To establish the analysis method of fingerprint forBoschniakiahimalaicaHook.f.et Thoms by UPLC and provide a reliable method for quality control ofB.himalaica.Methods：The fingerprint ofB.himalaicawas built by using Purospher C18as column and acetonirile-0.05% phosphoric acid aqueous in gradient as mobile phase.The flow rate was 0.8 mL·min-1，and the detecting wavelength was set at 278 nm.The fingerprints ofB.himalaicafrom different habitats were compared by Similarity Evaluation System for Chromatographic Fingerprint of CMM.Results：Samples fromdifferent habitats were of high similarities and 10 common peaks existed in thefingerprint.Each peak in the fingerprint was separated very well，satisfied to the requests of fingerprint.Conclusion：This RP-UPLC method is repeatable in analysis ofB.himalaicaand can be used in quality assessment ofB.himalaica.

BoschniakiahimalaicaHook.f.et Thoms；fingerprint；UPLC

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.4.010

2015-05-22)

中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務專項(YZYN-14-01);云南省中青年學術技術帶頭人后備人才培養(yǎng)項目(2013HB099)

*

李光，助理研究員，研究方向：民族藥藥理及開發(fā)，Tel:(0691)2136981，E-mail: lhbg311@hotmail.com; 陳曦，博士，研究員，研究方向：中藥新藥開發(fā)，E-mail：91chenxi12@163.com