金鐵鎖PtCYP450基因的克隆及原核表達△

李國棟，韓麗君，劉小莉，楊耀文，錢子剛

(云南中醫學院，云南 昆明 650500)

·基礎研究·

金鐵鎖PtCYP450基因的克隆及原核表達△

李國棟，韓麗君，劉小莉，楊耀文，錢子剛*

(云南中醫學院，云南 昆明 650500)

目的：從金鐵鎖PsammosilenetunicoidesW.C.Wu et C.Y.Wu中克隆細胞色素PtCYP450酶基因，進行序列分析和原核表達。方法：根據已獲得的金鐵鎖轉錄組數據，設計PtCYP450基因全長擴增引物，利用RT-PCR方法獲得金鐵鎖PtCYP450基因的全長cDNA序列，并進行TA克隆、測序及序列分析；構建金鐵鎖PtCYP450-03基因的原核表達載體pEASY-E1-CYP450，轉入BL21(DE3) Chemically Competent Cell中，在ArtMediaTMProtein Expression培養基中進行蛋白表達。結果：獲得全長1612 bp的金鐵鎖CYP450 cDNA，其開放閱讀框(ORF)為1560 bp，編碼519個氨基酸；序列分析及系統發育分析表明，PtCYP450基因屬于CYP710家族成員。構建了pEASY-E1-CYP450重組質粒，獲得穩定的原核表達體系，SDS-PAGE結果表明所表達的蛋白與預測的蛋白大小一致。結論：成功克隆了金鐵鎖PtCYP450基因，構建了穩定的pEASY-E1-CYP450原核表達體系，為進一步研究金鐵鎖中三萜皂苷合成代謝途徑及其關鍵酶表達模式奠定基礎。

金鐵鎖；PtCYP450；基因克隆；原核表達；序列分析

稀有瀕危物種金鐵鎖PsammosilenetunicoidesW.C.Wu et C.Y.Wu為石竹科(Caryophyllaceae)單型屬植物[1]，以根入藥，是“云南白藥”的主要原料藥之一，主治跌打損傷、風濕痛、癰疽瘡癤、創傷出血等癥[2]，主要有效成分為金鐵鎖三萜總皂苷[3]。MVA途徑是植物體內皂苷合成的主要途徑，在此途徑中有多種酶參與了次生代謝產物的合成及調控，如法尼基焦磷酸合成酶(FPS)、鯊烯環氧酶(SE)、鯊烯合成酶(SS)等都為三萜皂苷碳骨架形成相關的關鍵酶，它們的含量及表達對次生代謝產物的含量有重要影響[4-10]。三萜類骨架合成后，依賴細胞色素P450單加氧酶及糖基轉移酶對萜類骨架進行結構修飾，最終獲得各種各樣的三萜皂苷產物。細胞色素P450單加氧酶系廣泛分布于生物有機體內，參與了許多重要的生命過程，它在植物次生代謝產物的合成途徑中起到氧化作用，并在調控植物生長和發育中起到重要作用[11-14]。本研究根據已獲得的金鐵鎖轉錄組細胞色素P450單加氧酶基因序列，設計全長擴增引物，從金鐵鎖中成功提取了RNA，反轉錄為cDNA，并擴增出金鐵鎖P450基因全長cDNA序列，測序及序列分析后進行了克隆和原核表達，結果表明所構建的P450原核表達載體在大腸桿菌中成功表達目的蛋白。本研究為進一步研究金鐵鎖中三萜皂苷合成代謝途徑中關鍵酶表達模式奠定了基礎，為進一步確定和研究與金鐵鎖三萜皂苷合成代謝途徑相關的P450提供參考，也為其他生物中P450的研究提供參考。

1 材料與試劑

金鐵鎖Psammosilenetunicoides植株采自云南省大理市鶴慶縣馬場，栽培于云南中醫學院優良種苗繁育工程中心實驗室。本實驗材料為金鐵鎖根部。

質粒pEASY-T1 Vector、pEASY-E1Expression Vector、菌株DH5α、BL21(DE3)、ArtMediaTMProtein Expression(北京全式金生物技術有限公司)；Takara Minibest Universal RNA Extraction Kit、PrimeScriptTMⅡ1st strand cDNA Synthesis Kit、Taq DNA聚合酶、DL2000 DNA Marker[寶生物工程(大連)有限公司]；PCR產物回收試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質粒小量制備試劑盒(上海捷瑞生物工程有限公司)；一步法細菌活性蛋白提取試劑盒、引物合成和序列測序由上海生工生物工程技術服務有限公司完成；常用試劑及耗材(昆明鼎國生物技術有限公司)。

2 方法

2.1 金鐵鎖總RNA的提取及PtCYP450基因全長PCR擴增

按照Takara Minibest Universal RNA Extraction Kit試劑盒說明書提取金鐵鎖總RNA，-80 ℃保存備用；按照PrimeScriptTMⅡ 1st strand cDNA Synthesis Kit試劑盒說明書合成金鐵鎖第一鏈cDNA。根據金鐵鎖轉錄組中的一條PtCYP450序列，利用Primer5.0設計一對特異擴增引物。正向引物：5′-ATGAACACATCAGAAATCTGGG-3′；反向引物：5′-TCAGTCAAAGGAGAGAGGAAGAG-3′。采用25 μL反應體系，以第一鏈cDNA為模板進行擴增，PCR反應條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 2 min，共32個循環；72 ℃ 10 min；4 ℃終止。PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收并純化，測序得到DNA序列信息。測序結果經NCBI在線Blastx分析，DNAman軟件尋找該基因的ORF。分子進化樹構建用MEGA6.0軟件完成，選擇鄰接法，應用自舉檢驗1000次。

2.2 PtCYP450基因的克隆與表達載體構建

根據捷瑞PCR產物回收試劑盒說明書回收并純化擴增的片段，將4 μL擴增出的目的片段PtCYP450插入1 μL pEASY-T1載體中進行連接，連接產物轉化大腸桿菌DH5α。將轉化菌涂布于含有50 μg·mL-1氨芐青霉素的LB平板上，37 ℃培養過夜，挑取白色菌落培養，進行菌落PCR驗證后將陽性克隆送測序鑒定，提取陽性單克隆菌株質粒。將4 μL擴增出的PtCYP450目的片段插入1 μL pEASY-E1表達載體中進行連接，連接產物轉化大腸桿菌DH5α。將轉化菌涂布于含有50 μg·mL-1氨芐青霉素的LB平板上，37 ℃培養過夜，挑取單克隆進行PCR以鑒定陽性克隆，挑選正確表達方向的陽性克隆，200 r·min-1、37 ℃培養6 h，用試劑盒提取質粒，-20 ℃保存備用，獲得表達載體pEASY-E1-P450。

2.3 PtCYP450基因的原核表達

用所獲得的表達載體pEASY-E1-P450轉化BL21(DE3)表達感受態細胞，將轉化菌涂布于含有50 μg·mL-1氨芐青霉素的LB平板上，37 ℃培養過夜，挑取克隆，按照ArtMediaTMProtein Expression說明書加入適量體積的ArtMedia培養基內，250 r·min-1、37 ℃培養過夜，同時以相同條件的pEASY-E1空載體的轉化菌作為對照。收集菌液并根據一步法細菌活性蛋白提取試劑盒說明書進行蛋白提取，分別收集上清液和沉淀蛋白，-80 ℃保存備用。取4 μL沉淀與12 μL上清液混勻，加入4 μL蛋白上樣Buffer，100 ℃、5 min變性。將20 μL樣品上樣，進行SDS-PAGE(5%的濃縮膠和10%的分離膠)電泳測定。

3 結果與分析

3.1 金鐵鎖PtCYP450基因的擴增與克隆

提取金鐵鎖總RNA進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，所獲RNA條帶清晰(見圖1)，紫外分光光度計分析顯示A260/A280=1.96。表明所獲得的金鐵鎖RNA純度較好，可以用于擴增基因全長。將RNA反轉為第一鏈cDNA，利用設計的引物進行擴增全長，PCR產物經過1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到大小約為1600 bp的條帶(見圖1)，與預期的目的片段一致。

注：M.DL2000；1、2.金鐵鎖RNA；3、4.PCR擴增產物。圖1 金鐵鎖總RNA提取 及CYP450基因擴增

擴增產物測序后利用Sequencher 4.14軟件進行序列拼接，得到1612 bp的序列，開放閱讀框1560 bp，編碼519個氨基酸，推測分子量約為60 kD。在NCBI上進行BLast比對，結合相關文獻的查閱[15]，篩選出包括金鐵鎖PtCYP450在內的17條屬CYP710家族參與三萜皂苷生物合成的P450氨基酸序列。PtCYP450的核酸序列與其他植物的CYP450 710A1基因序列同源性為90%～70%，所編碼的蛋白與其他植物(甜菜、葡萄、苜蓿等)CYP450 710A1基因編碼的蛋白同源性高達98%～87%。使用MEGA6.0進行多序列的比對，采用鄰接法(NJ)構建進化樹，進行聚類分析，金鐵鎖PtCYP450與豆科的5個物種、十字花科的3個物種以及葡萄形成姐妹群，表明它們間親緣關系較近(見圖2)。結果表明克隆出的金鐵鎖PtCYP450基因屬于CYP450 710亞家族。

圖2 PtCYP450與其他物種CYP450 710家族氨基酸序列的進化樹分析

3.2 金鐵鎖PtCYP450基因的表達載體構建與蛋白表達

用擴增出的目的片段CYP450與 pEASY-T1載體的連接產物轉化大腸桿菌DH5α。將轉化菌涂布于LB平板上培養，挑取白色菌落進行菌落PCR驗證后將陽性克隆送測序鑒定，并提取質粒。根據pEASY-E1Expression Vector的構建圖譜，利用CYP450目的片段與pEASY-E1構建原核表達載體pEASY-E1-CYP450，重組質粒經PCR與測序后確定目的片段連接上了pEASY-E1載體。將重組質粒轉化到BL21(DE3)表達感受態細胞中，培養后用ArtMedia培養基誘導表達蛋白，蛋白經SDS-PAGE電泳測定，所表達的蛋白大小與預測蛋白大小一致(見圖3)，且pEASY-E1空載體轉化菌對照組在預測位置并沒有明顯表達蛋白，因此認為金鐵鎖CYP450基因原核表達成功。

注：M.蛋白Maker；1.pEASY-E1空載體對照；2.pEASY-E1-P450。圖3 SDS-PAGE電泳圖

3.3 金鐵鎖PtCYP450編碼蛋白特性分析

利用ExPASy Proteomics Server提供的在線工具ProtParam (http：//web.expasy.org/protparam/)預測分析金鐵鎖CYP450基因編碼的蛋白質的理化性質，預測結果如下：金鐵鎖CYP450基因編碼編輯519個氨基酸，分子質量約為60 kD，理論等電點值(pI)為6.58，總共包括8400個原子，分子式為C2720H4183N713O759S25，在這個CYP450蛋白的20種氨基酸中，亮氨酸(Leu)所占比例最高，達到11.4%，而色氨酸(Trp)所占比例最低，均為1.5%；正電荷殘基總數為59，負電荷殘基總數為61。蛋白的不穩定指數為41.57，脂肪指數為86.99，總平均親水性為-0.158。表明這是一個不穩定蛋白。

利用NPS@server在線軟件分析預測金鐵鎖CYP450編碼蛋白的二級結構，從預測結果可知，在CYP450蛋白二級結構組分中，α-螺旋(Hh)占46.24%，β-折疊(Ee)占6.17%，無規則卷曲占45.28%。利用SMART服務器分析金鐵鎖CYP450編碼蛋白的功能結構域，從分析結果可知，金鐵鎖CYP450編碼蛋白結構中，15～34位氨基酸間是一個跨膜螺旋區，第46～494位是細胞色素P450酶結構域，表明PtCYP450蛋白具有P450超家族結構域(見圖4)。

圖4 金鐵鎖CYP450編碼蛋白的結構功能域示意圖

利用SWISS-MODEL(http：//swissmodel.expasy.org/)對金鐵鎖PtCYP450編碼蛋白質進行三級結構預測分析，預測結果見圖5。

圖5 金鐵鎖CYP450編碼的蛋白質三級結構預測結果

4 討論

在自然界中，很多具有重要價值的三萜皂苷產量較低，利用栽培措施大幅度提高產量或利用化學合成藥用活性部分難度都很大。如果從分子水平上對其生物合成的關鍵基因進行研究調控，促進表達，能夠提高目標產物的量，產生良好的社會及經濟效益。目前，通過生物工程調控表達各種次生代謝產物關鍵酶的技術已日漸成熟，且取得了重大進展，是當前研究功能基因的熱點，采用生物技術來緩解資源短缺等問題是中醫藥現代化的主要目的之一。

細胞色素P450單加氧酶系廣泛分布于生物有機體內，是動植物生命過程重要的酶，在植物萜類生物合成過程中，CYP450家族成員起著十分重要的作用[15-17]。CYP450對三萜碳環骨架合成起著羥基化和氧化等一系列復雜的修飾作用，是三萜皂苷生物合成途徑中的關鍵酶。近年來，由于二代高通量測序技術的飛速發展，基于RNA-Seq的轉錄組測序技術為研究藥用植物功能基因提供了便利。本研究通過前期獲得的金鐵鎖轉錄組數據，首次從中成功克隆出了金鐵鎖的CYP450基因，并進行了相關的生物信息學分析，以及構建了原核表達載體pEASY-E1-CYP450，將重組質粒轉化到BL21(DE3)中，成功誘導表達出PtCYP450蛋白。根據氨基酸序列相似性及系統進化關系，可將CYP450分為不同的家族和亞家族。本文所克隆出的金鐵鎖PtCYP450的核酸序列與其他植物的CYP450 710A1基因序列同源性為90%～70%，結合系統發育分析的結果，初步確定其為CYP450 710亞家族。該研究為下一步確定參與金鐵鎖三萜皂苷合成代謝的CYP450s以及進行生物功能驗證分析奠定基礎，也將有助于深入研究金鐵鎖中三萜皂苷生物合成代謝途徑。

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CloningandProkaryoticExpressionofPtCYP450GeneinPsammosilenetunicoides

LIGuodong，HANLijun，LIUXiaoli，YANGYaowen，QIANZigang*

(YunnanUniversityofTraditionalChineseMedicine，Kunming650500，China)

Objective：To obtain the key enzyme genePtCYP450 involving in the triterpenesaponins biosynthesis，aPtCYP450 gene was cloned fromPsammosilenetunicoidesand prokaryotic expression were performed.Methods：According toone of thePtCYP450 gene sequences of transcriptome ofP.tunicoides，a pair of primers were designed，and the ORF (Open readingframe)of cDNA sequences was obtained by RT-PCR.Then TA cloning，sequencing，and sequence analysis were performed.Prokaryoticexpression vector pEASY-E1-CYP450was constructed and transformed intoE.coliRosetta (DE3) for the expression under theinduction of Isopropyl ArtMediaTMProtein Expression.Results：The ORF ofGrCYP450 has a length of 1560 bp coding for 519amino acids.Sequence analysis andphylogenic analysis showed thatPtCYP450 was the member of CYP710subfamily.The SDS-PAGE results showed that the expressed proteins were consistent with theanticipated size.Conclusion：ThePtCYP450 gene is successfully cloned，and the stable prokaryotic expression system is established.This study will provide a foundation for the further purification，structural and functional researches of CYP450 protein.

PsammosilenetunicoidesW.C.Wu et C.Y.Wu；PtCYP450；gene cloning；prokaryotic expression；sequence analysis

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.6.015

2016-01-04)

國家自然科學基金(81260609，81560613)；云南省自然科學基金[2014FD035，2015FB205(-015)]；中央本級重大增減支項目 (2060302)

*

錢子剛，教授，研究方向：中藥資源學；Tel：(0871) 65918214，E-mail：qianzig@aliyun.com