不同濕度貯藏條件下南方紅豆杉多糖含量動態(tài)變化的研究△

陳發(fā)軍，張春椿，余楊，熊耀康*

(1.麗水市科技局生產力促進中心，浙江 麗水 323000；2.浙江中醫(yī)藥大學，浙江 杭州 310053)

·中藥農業(yè)·

不同濕度貯藏條件下南方紅豆杉多糖含量動態(tài)變化的研究△

陳發(fā)軍1，張春椿2，余楊1，熊耀康2*

(1.麗水市科技局生產力促進中心，浙江 麗水 323000；2.浙江中醫(yī)藥大學，浙江 杭州 310053)

目的：研究研究南方紅豆杉枝條在不同濕度貯藏環(huán)境下多糖的含量變化，確定南方紅豆杉多糖最佳貯藏濕度環(huán)境。方法：設置了65%RH、75%RH和85%RH三個貯藏濕度，通過測量不同濕度貯藏環(huán)境下南方紅豆杉總多糖的含量變化，以確定最佳濕度貯藏條件。結果：南方紅豆杉總多糖含量呈先升高后又開始下降的跡象，總多糖在0～3個月中65%RH﹥75%RH﹥85%RH。結論：南方紅豆杉多糖成分最佳的貯藏環(huán)境是65%RH低濕環(huán)境。

南方紅豆杉；多糖；濕度

南方紅豆杉Taxuschinensisvar.mairei(Lemee et Levl.)Cheng et L.K.Fu系裸子植物亞門(Cymnospermai)、松杉綱(Coniferopside)、紅豆杉目(taxales)紅豆杉科(Taxaceae S.F.Gery) 中紅豆杉族(TaxeaeMilchior et Werd)下屬的紅豆杉屬(TaxusLinn)植物[1]，素有“植物黃金”之稱[2]。據《本草綱目》記載：“性辛、味甘，具有解毒、散結、止痛等功效”[3]。主要分布于長江流域、南嶺山脈[4]，其栽培品和和野生品的紫杉醇含量相當，所以可能成為生產紫杉醇的一個主要栽培種[5-6]。紅豆杉內除了含有紫杉烷類有效成分，還含有多糖和黃酮[7]。現(xiàn)研究表明紅豆杉多糖在腫瘤生長的抑制作用、對整體動物的耐受力的增強作用、對免疫低下小鼠的免疫功能提高作用和提高生命延長率等方面具有良好抗腫瘤活性[8]。按照目前的提取工藝，枝葉在提取紫杉醇后往往被丟棄，這樣形成了極大的資源浪費。不同的貯藏環(huán)境下藥材質量差異顯著，濕度是眾多環(huán)境因子中影響較為顯著的因子。有研究指出紅豆杉枝葉中紫杉醇含量為0.020 6%，多糖成分含量為1.54%～5.45%[9]，而南方紅豆杉貯藏過程中的多糖的含量未見報道。尋找最佳貯藏條件，減少藥材在貯藏過程中有效成分遺失，提高紅豆杉藥材質量至關重要。本文系統(tǒng)地研究采收后南方紅豆杉帶葉枝條在不同濕度貯藏環(huán)境下多糖的含量變化，確定南方紅豆杉多糖最佳貯藏濕度環(huán)境，從資源保護的角度使得南方紅豆杉藥用植物資源能夠得到充分的開發(fā)應用，為建立南方紅豆杉的貯藏環(huán)境要求提供理論依據和堅實基礎，為豐富其資源利用奠定基礎。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Spectrumlab22可見分光光度計(上海樓光技術有限公司)、AB135-S電子天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)、KQ5200超聲清洗器(昆山市超聲波儀器有限公司)等。

1.2 藥材

本文采用的南方紅豆杉藥材均由寧波泰康紅豆杉生物工程有限公司提供，經浙江中醫(yī)藥大學張水利教授鑒定為南方紅豆杉Taxuschinensisvar.mairei(Lemee et Levl.) Cheng et L.K.Fu的帶葉枝條；葡萄糖標準品購自中國食品藥品檢定研究院；其他試劑均為國產分析純。

2 實驗方法

2.1 藥材處理

本文根據浙江省天氣特點和南方紅豆杉特性設置了65%RH、75%RH(常濕)和85%RH三個貯藏濕度。在干燥器內放置一大小適宜的盛有適當濃度硫酸的敞口錐形瓶，按控制相對濕度用的硫酸溶液表配置65%RH、75%RH和85%RH三個貯藏濕度，同時內部放一溫濕度計，預先準備好的相對濕度控制箱密閉一定時間后，靜置穩(wěn)定，將選好的南方紅豆杉帶葉枝條置其中堆放，溫度控制在20±5 ℃，均不遮光，每隔5 d翻動檢查一次。自貯藏開始每隔15 d取樣一次，每組平行3份，為期3個月，測定各指標性成分的含量，以新鮮樣品(貯藏0d)測得的考察指標為對照。

2.2 多糖含量測定

2.2.1 總多糖提取 取南方紅豆杉提取完紫杉醇后的藥渣，攤曬過夜后，精密稱取樣品1.5 g，平行3份，于150 mL三角錐形瓶中，加入30倍量蒸餾水，超聲提取30 min，超聲功率為80 W，過濾藥渣；濾液中加入0.5 g粉末型活性炭脫色，攪拌后靜置30 min，濾除炭，定容到50 mL；將濾液進行Sevage法除蛋白(正丁醇∶氯仿=1∶4)，于分液漏斗中反復振搖至溶液分界面交界處無白色混懸(5次)，合并濾液，濃縮并定容到50 mL；從濃縮濾液中精密吸取2.0 mL加入4倍體積的無水乙醇，至乙醇體積分數達到80%，冰箱靜置24h后，4000 rpm高速離心5 min，倒去上清液，沉淀部分加3.0 mL蒸餾水溶解，即得[10-11]。

2.2.2 總多糖測定 采用苯酚-硫酸法，精密吸取對照品溶液2.0 mL，置20 mL具塞試管內，加5%苯酚1.0 mL和濃硫酸試劑5.0 mL，加塞，立即搖勻，室溫(25 ℃)放置1 min后，置于沸水浴15 min，冰水浴3 min后取出，再室溫放置10 min后，用紫外分光光度計測定吸光度。

3 實驗結果

3.1 苯酚-硫酸法測定總多糖含量方法的建立

3.1.1 標準品溶液的制備 精密稱取105 ℃干燥至恒重的D-葡萄糖對照品0.249 mg，加蒸餾水溶解并定容至250 mL容量瓶中，搖勻，即得0.996 mg·mL-1葡萄糖標準品溶液，備用。

3.1.2 最佳檢測波長的選擇 采用苯酚-硫酸法，精密吸取對照品溶液2.0 mL置20 mL具塞試管內，加5%苯酚1.0 mL和濃硫酸試劑5.0 mL，加塞，立即搖勻，室溫(25 ℃)放置1 min后，置于沸水浴15 min，冰水浴3 min后取出，再室溫放置10 min后，用紫外分光光度計在460～520 nm處掃描，于490 nm有最大吸收(A)，因此，選擇490 nm為測定波長。

3.1.3 標準曲線的制作 精密吸取0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL對照品溶液置10.0 mL具塞試管內，濃度分別為0.000、0.010 0、0.019 9、0.039 8、0.059 8、0.079 7、0.099 6 mg·mL-1，按“2.2.2”的含量測定方法，在490 nm波長處測定吸光度。以首管為空白對照，以吸光度對濃度作標準曲線得方程為：Y=0.939 3X+0.006 4(r=0.999 5)，其中Y代表吸光度A，X代表濃度。結果表明，葡萄糖在濃度0.010 0～0.099 6 mg·mL-1范圍內與吸光度呈良好的線性關系。

3.1.4 穩(wěn)定性試驗 精密吸取供試品液，按“2.2.2”的含量測定方法，在490 nm波長處間隔一定時間測定吸光度，測得RSD=1.27%，結果表明在150 min內呈良好的穩(wěn)定性。結果見表1。

表1 南方紅豆杉總多糖測定方法中穩(wěn)定性試驗

3.1.5 精密度試驗 取同一份南方紅豆杉的供試品溶液，按“2.2.2”的含量測定方法，在490 nm波長處測定吸光度，重復6次，測得RSD=2.11%，結果表明精密度良好。結果見表2。

3.1.6 重復性試驗 取同一南方紅豆杉藥材6份，按“2.2.1”的總多糖提取方法提取，并按“2.2.2”的含量測定方法，在490 nm波長處測定吸光度，測得RSD=3.86%，結果表明重現(xiàn)性良好。結果見表2。

表2 南方紅豆杉總多糖測定方法中精密度試驗、重復性試驗結果

3.1.7 回收率試驗 精密吸取已知含量的南方紅豆杉多糖供試品5份，加入一定量葡萄糖標準品溶液，按“2.2.2”的含量測定方法，在490 nm波長處測定吸光度，計算得平均回收率為97.40%，RSD=1.44%。結果見表3。

表3 南方紅豆杉多糖回收率試驗測定結果

3.2 總多糖含量測定結果

3.2.1 新鮮南方紅豆杉總多糖含量測定結果 精密吸取新鮮南方紅豆杉供試品溶液2.0 mL，以2.0 mL蒸餾水為空白對照，每管加5%苯酚1.0 mL和濃硫酸試劑5.0 mL，加塞，立即搖勻，室溫(25 ℃)放置1 min后，置于沸水浴15 min，冰水浴3 min后取出，再室溫放置10 min后，按“2.2.2”的含量測定方法，在490 nm波長處測定吸光度。按照標準曲線求得其含量，結果見表4。

表4 新鮮南方紅豆杉多糖的含量 (%)

3.3 不同濕度下總多糖含量測定結果

取不同濕度下南方紅豆杉總多糖供試品溶液，按“2.2.2”的含量測定方法，在490 nm波長處測定吸光度，結果見表5，圖1。

表5 不同濕度下南方紅豆杉總多糖含量測定結果(%)

圖1 不同貯藏濕度下南方紅豆杉總多糖的含量變化

4 討論

自然貯藏環(huán)境因子通過影響南方紅豆杉的主要生理生化進而影響了南方紅豆杉表現(xiàn)出的各種特性，如抗逆性和次生代謝物含量變化。自然貯藏環(huán)境因子對南方紅豆杉各項生理活動的影響錯綜復雜，多個貯藏環(huán)境因子可能作用于同一個代謝過程，而且各個環(huán)境因子間也相互作用，呈現(xiàn)出網狀關系。本文考察了濕度這主要的影響因素，并從極端環(huán)境考察其對南方紅豆杉多糖的含量變化隨著貯藏時間變化的規(guī)律，選擇出最佳的濕度貯藏條件，為確定南方紅豆杉最佳貯藏環(huán)境提供理論依據和有效基礎。

由表5，圖1看出3種濕度貯藏下的南方紅豆杉總多糖的含量變化趨勢總體相同，均隨著貯藏時間的延長呈先上升后下降的趨勢變化。南方紅豆杉總多糖的含量是基本上是65%RH>75%RH>85%RH的，且當貯藏濕度為85%RH，貯藏天數為15 d時，南方紅豆杉總多糖含量達到最高值5.69%，75%RH貯藏下第45 d含量最高值5.71%，65%RH貯藏下第60 d含量最高值5.98%，隨后均下降。在貯藏3個月后，65%RH組降到4.64%，75%RH組降到了4.36%，85%RH組降到了2.21%，其中只有85%RH組比0 d是降低的，其余兩組都是升高的。

結果表明南方紅豆杉在3個濕度水平貯藏條件下，隨著貯藏濕度的升高和時間的延長，總多糖含量先升高后又開始下降的跡象；在65%RH環(huán)境下貯藏，相對于75%RH環(huán)境下水分被吸收，呼吸作用較弱，多糖含量較高；而隨著濕度的增高，85%RH環(huán)境下貯藏，相對于75%RH環(huán)境下反而吸收水分，呼吸速率較強，放出的熱量和水汽增多，多糖含量較低，考慮到可能高濕環(huán)境影響霉菌的生長，分解多糖。所以，初步可確定在65%RH環(huán)境下更有利于南方紅豆杉總多糖含量的保持和累積。此外，本文在提取完紫杉烷類成分后的南方紅豆杉藥渣中提取多糖，從資源保護的角度使得南方紅豆杉藥用植物資源能夠得到充分的開發(fā)應用，為豐富其資源利用的奠定基礎。

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DynamicChangeofPolysaccharideContentinSouthChineseYewunderStorageConditionsofDifferentHumidity

CHENFajun1，ZHANGChunchun2，YUYang1，XIONGYaoKang2*

(1.ProductivityPromotionCenterofLishuiMunicipalScienceandTechnologyBureau,Lishui323000,China;2.ZhejiangChineseMedicalUniversity,Hangzhou310053,China)

Objective：To determine the content of polysaccharides in the branches of the southern branch of theTaxuschinensisvar.mairei(Lemee et Levl.)Cheng et L.K.Fu under storage conditions of different humidity，and determine the optimum storage humidity environment of the polysaccharide in theT.chinensisvar.mairei.Methods：The content of polysaccharide inT.chinensisvar.maireiwas measured under 65% RH，75% RH and 85% storage condition to select optimal storage condition.Results：The total polysaccharide content ofT.chinensisvar.maireiincreased firstly and then decreased，and the total polysaccharide under different storage condition was as follows：65%RH>75%RH>85%RH in 0-3 months.Conclusion：The best storage environment of the polysaccharide component ofT.chinensisvar.maireiis 65%RH low humidity environment.

Taxuschinensisvar.mairei(Lemee et Levl.)Cheng et L.K.Fu；polysaccharide；humidity

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.6.018

2016-01-20)

國家中醫(yī)藥行業(yè)科研專項(201407002)；麗水市科技計劃項目(2014JDJS02)；麗水市科技特派員項目(2013tpy02)；中央本級重大增減支項目(2060302)

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熊耀康，教授，研究方向：中藥品質評價及資源開發(fā)利用；E-mail：xiongyaokang@126.com