分離篩選淡豆豉發(fā)酵菌的培養(yǎng)基優(yōu)化△

陳麗艷，劉青，張蕾，方自若，王偉明

(黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院 中藥研究所，哈爾濱 150036)

分離篩選淡豆豉發(fā)酵菌的培養(yǎng)基優(yōu)化△

陳麗艷，劉青，張蕾，方自若，王偉明*

(黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院 中藥研究所，哈爾濱 150036)

目的：優(yōu)化適用于淡豆豉發(fā)酵菌種分離篩選的選擇性培養(yǎng)基以達(dá)到科學(xué)、簡便、快速獲得淡豆豉優(yōu)勢發(fā)酵菌的目的。方法：采用含有桑葉、青蒿煎煮液的藥性培養(yǎng)基與另外4種微生物常規(guī)培養(yǎng)基包括馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)，孟加拉紅(RA)，察氏瓊脂(CA)，營養(yǎng)瓊脂(NA)于(28±2) ℃恒溫培養(yǎng)淡豆豉發(fā)酵菌，比較菌群組成、比例的變化規(guī)律。結(jié)果：采用含青蒿、桑葉藥性選擇性培養(yǎng)基分離篩選淡豆豉發(fā)酵菌優(yōu)于其他5種常規(guī)培養(yǎng)基，體現(xiàn)出科學(xué)、簡便、快速、專一的特性。結(jié)論：根據(jù)不同發(fā)酵輔料，確立專屬選擇性培養(yǎng)基的方法同樣可以應(yīng)用于各種發(fā)酵類中藥優(yōu)勢發(fā)酵菌的分離篩選。

淡豆豉；選擇性培養(yǎng)基；發(fā)酵菌

淡豆豉(SojaeSemenPraeparatum)是以大豆(Glycinemax(L.)Merr)為主要原料，以青蒿、桑葉等為輔料經(jīng)過發(fā)酵加工而成的中藥飲片，具有解表，除煩，宣發(fā)郁熱的功效，用于感冒，寒熱頭痛，煩躁胸悶，虛煩不眠[1]。淡豆豉始載于《名醫(yī)別錄》，歷代本草均有收載，自有記載以來，淡豆豉一直按傳統(tǒng)發(fā)酵工藝以青蒿、桑葉、大豆為原料借助自然環(huán)境中的微生物發(fā)酵制得[2]。由于生產(chǎn)地域、環(huán)境條件、原料來源、生產(chǎn)季節(jié)等因素的影響，參與發(fā)酵的微生物種群變化較大，不僅有發(fā)酵優(yōu)勢菌群，也混入一些與發(fā)酵無關(guān)甚至有害微生物，導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定、不可控，可能存在安全隱患[3-5]。因此，對參與發(fā)酵中藥的微生物種群進行考查，保留適應(yīng)發(fā)酵的優(yōu)勢菌、剔除雜菌至關(guān)重要。本研究通過與普通培養(yǎng)基對比，優(yōu)化適用于淡豆豉發(fā)酵菌種分離篩選的選擇性培養(yǎng)基以達(dá)到科學(xué)、快速、簡便獲得淡豆豉優(yōu)勢發(fā)酵菌。

1 材料

1.1藥材

淡豆豉中藥飲片(購自哈爾濱北京同仁堂藥店，批號：20150801)。桑葉(批號：140101)、青蒿(批號：140101)購自河北祁新中藥顆粒飲片有限公司，以上淡豆豉飲片及藥材經(jīng)黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院王偉明研究員鑒定為淡豆豉為大豆Glycinemax(L.) Merr.的成熟種子的發(fā)酵加工品，桑葉為桑MorusalbaL.的干燥葉，青蒿為黃花蒿ArtemisiaannuaL.的干燥地上部分。

1.2儀器

迅數(shù)MF3型多功能一體機(杭州迅數(shù)科技有限公司)，DHP9272恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)，DL-CJ-2N凈化工作臺(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司)，BSA224S賽多利斯電子天平(德國賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)。

1.3培養(yǎng)基

察氏瓊脂培養(yǎng)基(CA，20150508)，營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(NA，20150428)，馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA，20150916)，瓊脂粉(20150606)，均購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；孟加拉紅培養(yǎng)基(RA，20141220)購自青島海博生物技術(shù)有限公司；Corning培養(yǎng)皿(φ=90mm，美國Coring公司)。

1.4藥性選擇性培養(yǎng)基的配制

1.4.1桑蒿瓊脂培養(yǎng)基(SHA)：取青蒿70～100g，桑葉70～100g，加水煎煮2h，過濾，濾液濃縮至1000mL，加黃豆粉30g，葡萄糖20g，瓊脂15g，121℃高壓滅菌20min。

1.4.2黃豆粉瓊脂培養(yǎng)基(桑蒿培養(yǎng)基空白對照)：黃豆粉30g，葡萄糖20g，瓊脂15g，蒸餾水1000mL，121℃高壓滅菌20min。

1.4.3PDA、RA、CA、NA培養(yǎng)基按照說明書使用前配制，滅菌備用。

2 方法

2.1淡豆豉菌液的提取及制備

取淡豆豉飲片5g，在無菌條件下用0.9%的無菌生理鹽水洗滌三次，除去中藥淡豆豉飲片上附著的雜質(zhì)，然后轉(zhuǎn)移至已滅菌的研缽中加45mL無菌生理鹽水研磨，制成稀釋度為10-1的菌液母液，按照10倍稀釋法依次用無菌生理鹽水進行梯度稀釋，得到稀釋倍數(shù)為10-2～10-9的菌液，涂于不同培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，根據(jù)每種培養(yǎng)基生長的菌落數(shù)量選擇合適的稀釋度。

2.2淡豆豉發(fā)酵菌培養(yǎng)基優(yōu)化

2.2.1桑葉、青蒿不同加藥量對淡豆豉發(fā)酵菌群生長影響 根據(jù)2015年版《中國藥典》淡豆豉的制備工藝[1]中桑葉、青蒿的加入量，按照青蒿70～100g、桑葉70～100g的不同比例進行組合，共組合16組，每組編號及青蒿、桑葉比例見表1，每組加水煎煮2h獲得煎煮液并濃縮至1000mL。以黃豆粉瓊脂培養(yǎng)基(以蒸餾水代替桑葉、青蒿煎煮液)為對照(編號17)，按照1.4配制桑蒿瓊脂培養(yǎng)基與黃豆粉瓊脂培養(yǎng)基，滅菌前測定培養(yǎng)基的PH值。

每個編號平行3個培養(yǎng)皿，將100μL菌液接種到SHA培養(yǎng)基和黃豆粉瓊脂培養(yǎng)基上，(28±2)℃恒溫培養(yǎng)6d，每天觀察并記錄各組出現(xiàn)的菌群類型及生長情況。

表1 藥性培養(yǎng)基的編號及青蒿、桑葉的比例(g：g)

2.2.2 不同培養(yǎng)基對淡豆豉發(fā)酵菌群種類的分離篩選：將100 μL菌液分別接種至PDA、NA、CA、RA培養(yǎng)基。每種培養(yǎng)基平行三個皿，(28±2) ℃恒溫培養(yǎng)6 d，每天觀察并記錄出現(xiàn)菌群類型及生長情況。

2.3菌種的分離純化

將以上5種培養(yǎng)基生長的菌落進行分離純化，用無菌接種環(huán)挑取單個菌落在PDA培養(yǎng)基上分區(qū)劃線培養(yǎng)，分離的單個菌落再移接至PDA斜面試管中培養(yǎng)、保存。

2.4分離菌株在不同培養(yǎng)基的生長情況考察

根據(jù)2.3培養(yǎng)分離菌的菌落形態(tài)及顯微特性初步鑒別為1號毛霉、2號毛霉、酵母菌、桿菌、球菌及3號霉菌(疑似曲霉)，將以上6株菌分區(qū)接種至不同培養(yǎng)基的同一培養(yǎng)皿中，(28±2) ℃恒溫培養(yǎng)48h，觀察并記錄菌的生長情況。

2.5以上實驗重復(fù)兩次。

3 結(jié)果

3.1桑葉青蒿加藥量的確定

采用PH試紙測得1～17號培養(yǎng)基的PH值均在6～7之間，菌種生長情況如表2。1～16號各組菌群生長表型相近，數(shù)量波動較小，不同生長時期可見明顯的菌群特征，培養(yǎng)第3d時皆霉菌布滿平皿。17號黃豆粉培養(yǎng)基中細(xì)菌數(shù)目較多，雖然個別培養(yǎng)皿中有霉菌出現(xiàn)，但生長不旺盛。桑葉、青蒿的不同配比對淡豆豉優(yōu)勢菌群的生長影響無顯著差異，根據(jù)桑葉、青蒿的作用不同及文獻報道(詳見4討論部分)確定桑葉100g、青蒿70g的水煎液濃縮至1000mL，再加葡萄糖、黃豆粉、瓊脂配制成SHA培養(yǎng)基。

表2 青蒿、桑葉不同加藥量制得的SHA培養(yǎng)基菌群生長特征

3.2不同培養(yǎng)基對淡豆豉發(fā)酵菌種的分離篩選

通過實驗篩選，最終確定稀釋度為10-3的菌液在不同培養(yǎng)基上培養(yǎng)菌落分布及數(shù)量適宜，菌群類型及表型數(shù)目如圖2和表3。

圖2 淡豆豉菌液在不同培養(yǎng)基的生長情況直觀圖

培養(yǎng)基菌群類型表型數(shù)目SHA細(xì)菌、霉菌3NA細(xì)菌、霉菌4PDA細(xì)菌、霉菌、酵母5RA霉菌2CA霉菌、酵母3

圖2和表3顯示PDA培養(yǎng)基上表型數(shù)目最多，以優(yōu)勢的毛霉為主；NA培養(yǎng)基上細(xì)菌繁多，霉菌生長有顏色變化；RA培養(yǎng)基上霉菌生長較旺盛，根據(jù)菌落形態(tài)的不同可區(qū)分出不同霉菌菌株；CA培養(yǎng)基上細(xì)菌菌落較其他培養(yǎng)基生長的菌落大，可以根據(jù)形態(tài)表型加以識別，霉菌無色，表層或有星點狀物；SHA培養(yǎng)基上明顯可見三種菌群表型，面積最大的一種疑似高大毛霉，有兩個霉菌菌落的表面布滿灰色顆粒狀，還有數(shù)量最多的一種細(xì)菌，可以觀察到細(xì)菌由凸出奶白色油滴狀逐漸失水干癟皺縮顏色變黃，霉菌由初生時白色菌絲到后期顏色變灰或皺縮后表面呈現(xiàn)顆粒狀。

3.3分離菌株在不同培養(yǎng)基的生長情況考察

6種菌株在不同培養(yǎng)基的生長情況如圖3和表4。表4顯示SHA培養(yǎng)基對1號和2號霉菌的生長均顯示一定的促進作用，對3號霉菌有一定抑制作用，對4號、5號細(xì)菌的生長也顯示出抑制作用，對酵母菌的生長無明顯影響；NA培養(yǎng)基對2號霉菌和3號霉菌生長有抑制作用，細(xì)菌生長旺盛，故可以用于細(xì)菌的培養(yǎng)；PDA培養(yǎng)基上所有菌均生長較好，故而用其制作斜面試管用于菌種初期的分離與后期

1：1號毛霉；2：2號毛霉；3：酵母；4：桿菌；5：球菌；6：3號霉菌(疑曲霉)圖3 分離菌株在不同培養(yǎng)基上的生長情況

保存；RA培養(yǎng)基上3號霉菌長勢較SHA培養(yǎng)基好，但不如PDA培養(yǎng)基，PDA培養(yǎng)基上可見綠色老菌絲，RA培養(yǎng)基上酵母菌生長較好，桿菌、球菌生長被抑制，所以可用于霉菌的純化；CA培養(yǎng)基所有的菌生長均不太旺盛，因其為化學(xué)合成培養(yǎng)基，成分較穩(wěn)定，故可以用于霉菌顯微形態(tài)學(xué)鑒定。結(jié)合圖3，對比2號霉菌在各培養(yǎng)基上生長情況可知，SHA培養(yǎng)基不會造成發(fā)酵菌的缺失；對比球菌和3號霉菌在不同培養(yǎng)基上的生長情況可知，SHA培養(yǎng)基可有效抑制雜菌的生長。

表4 分離菌株在不同培養(yǎng)基的生長情況

4 討論

區(qū)別于天培、納豆等其他豆類發(fā)酵食品、保健品[6，7]，中藥淡豆豉在發(fā)酵中加入青蒿、桑葉兩味中藥做輔料，明確具有解表，除煩，宣發(fā)郁熱的藥用功能。其中青蒿能夠清虛熱、除骨蒸、解暑熱、截瘧、退黃；桑葉能夠疏散風(fēng)熱、清肺潤燥、清肝明目。根據(jù)2015年版《中國藥典》規(guī)定，青蒿、桑葉是淡豆豉發(fā)酵的重要外部環(huán)境，用青蒿、桑葉煎煮液制備培養(yǎng)基,用來培養(yǎng)淡豆豉發(fā)酵菌可以模擬淡豆豉發(fā)酵時的外部環(huán)境，對菌種進行篩選。通過實驗對比，青蒿、桑葉的不同配比制成的SHA培養(yǎng)基對淡豆豉發(fā)酵菌的生長無顯著影響，又由于桑葉具抑菌作用，可以用來抑制或干擾與本發(fā)酵無關(guān)的細(xì)菌滋生[8]，且能夠影響淡豆豉的解表、宣發(fā)郁熱功效，所以選擇桑葉最大量100g；青蒿能夠殺滅瘧原蟲等致病蟲的配子體，用量相對少，選擇青蒿最小量70g的組合[9]。適當(dāng)?shù)纳Ｈ~、青蒿用量可保證中藥淡豆豉的功效，這也與河北醫(yī)科大學(xué)牛麗穎教授研究以大豆苷元、染料木素、異黃酮目標(biāo)產(chǎn)物的含量為標(biāo)準(zhǔn),確定桑葉加樣量最高，青蒿次之的結(jié)果一致[10]。

SHA培養(yǎng)基用2%的葡萄糖做碳源，用3%的黃豆粉做氮源[11]，加入青蒿、桑葉煎煮液模擬菌種生長環(huán)境，針對性強，可完全滿足中藥淡豆豉發(fā)酵中所有優(yōu)勢菌群的生長需要，不會造成菌群缺失；選擇性好，優(yōu)勢菌群可以在發(fā)酵過程中壯大，有效抑制雜菌的生長，從而避免雜菌的干擾和影響。采用含青蒿、桑葉藥性選擇性培養(yǎng)基在分離篩選中藥淡豆豉發(fā)酵菌中優(yōu)于常規(guī)分離篩選培養(yǎng)基，體現(xiàn)出科學(xué)、簡便、快速、專一的特性。根據(jù)不同藥性基質(zhì)，確立專屬選擇性培養(yǎng)基的方法同樣可以嘗試應(yīng)用到其他發(fā)酵中藥如六神曲等優(yōu)勢菌種的篩選。

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OptimizationofSelectiveMediumtoIsolateFermentationMicrobesfromSojaeSemenPraeparatum

CHENLiyan，LIUQing，ZHANGLei，F(xiàn)ANGZiruo，WANGWeiming*

(HeilongjiangAcademyofTraditionalChineseMedicine，InstituteofChineseMateriaMedica，Harbin150036,China)

Objective：This study is aimed to optimize the selective medium to isolate Sojae Semen Praeparatum fermentation microbes sciencely，simplely and quickly.Methods：Four conventional medium：potato extract glucose agar medium (PDA)，Martin's medium (RA)，Czapek's agar medium (CA)，Nutrient agar (NA) were compared with the medicinal medium contained with extract liquid from Mori Folium and Artemisiae Annuae Herba，which are used to culture and isolate fermentation microbes from Sojae Semen Praeparatum at (28±2) ℃ to observe variation law of microbial flora and proportion.Results：The selective medium contained Mori Folium and Artemisiae Annuae Herba extract liquid was superior to the conventional medium to isolate Sojae Semen Praeparatum fermentatiom microbes.Medicinal medium showed the features of science，simplicity，rapidity and uniqueness.Conclusion：According to the different fermentation medicinal matrix，establishing the method of exclusive and selective medium can also be applied to other fermentation Chinese medicine.

Sojae Semen Praeparatum；selective medium；fermentation microbes

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.7.005

2016-01-25)

公益性行業(yè)科研專項經(jīng)費項目(201507004-03)

*

王偉明，研究員;研究方向：中藥基礎(chǔ)研究及應(yīng)用開發(fā)；Tel：(0451)55665478，E-mail：1442540238@qq.com