五味子水提工藝優(yōu)化及液質(zhì)聯(lián)用測定方法研究△

王梅，劉明明，梁晨光，史鑫波，白宏博，宋忠興，劉妍如，唐志書*

(1.陜西中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，陜西 咸陽 712000；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)/陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西省中藥基礎(chǔ)與新藥研究重點實驗室，陜西 咸陽 712083)

·中藥工業(yè)·

五味子水提工藝優(yōu)化及液質(zhì)聯(lián)用測定方法研究△

王梅1，劉明明2，梁晨光2，史鑫波2，白宏博2，宋忠興2，劉妍如2，唐志書2*

(1.陜西中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，陜西 咸陽 712000；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)/陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西省中藥基礎(chǔ)與新藥研究重點實驗室，陜西 咸陽 712083)

目的：以Plackett-Burman-Central Composite Design(PB-CCD)設(shè)計為基礎(chǔ)，通過分析五味子的LC-MS/MS液質(zhì)聯(lián)用儀測出的譜圖優(yōu)選五味子的水提工藝。方法：以五味子醇甲及五味子酯甲的含量為指標(biāo)，以浸泡時間、液固比、溶劑PH值、提取時間、提取次數(shù)、提取溫度及濃縮溫度為考察因素，采用PB-CCD優(yōu)選水提工藝條件并進(jìn)行含量測定分析。結(jié)果：選定最佳提取工藝為浸泡時間2 h，提取時間1 h，提取溫度70 ℃，提取次數(shù)5次，溶劑pH值5.0，濃縮溫度60 ℃。結(jié)論：PB-CCD優(yōu)選五味子提取工藝方法簡單，可為五味子的提取生產(chǎn)工藝提供參考。

PB-CCD實驗設(shè)計；液質(zhì)聯(lián)用；五味子；五味子醇甲；五味子酯甲

五味子系木蘭科植物五味子Schisandrachinensis(Turcz.)的干燥成熟果實。化學(xué)研究表明，其主要成分為五味子醇甲、五味子酯甲等聯(lián)苯環(huán)辛烯型木脂素類成分，具有降低血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶的作用，臨床上用于治療急、慢性肝炎[1-3]。目前研究顯示，五味子及含有五味子的中藥復(fù)方制劑在治療糖尿病、抑郁癥、失眠、慢性腎炎方面有顯著療效。同時，其主要成分五味子醇甲對β-淀粉樣蛋白損傷PC12細(xì)胞顯示出一定的保護(hù)作用，提示五味子對阿爾茨海默病治療的潛力[4-7]。目前，國內(nèi)多采取正交設(shè)計或均勻設(shè)計法優(yōu)化中藥的提取工藝，這兩種方法多采用線性數(shù)學(xué)模型，雖然具有簡便、試驗次數(shù)較少等優(yōu)點，但精確度不太高。而PB-CCD是近幾年來國外藥學(xué)工作者常用的集數(shù)學(xué)和統(tǒng)計方法于一體的試驗設(shè)計方法，其原理是根據(jù)與實驗中心點距離相等的試驗點，以自變量的極端水平為試驗所允許的極值，通過一次設(shè)計，計算結(jié)果可得到較佳條件。與常用的試驗設(shè)計，如均勻設(shè)計相比，其精度較高、操作簡便。效應(yīng)面優(yōu)化法通過描繪效應(yīng)對考察因素的效應(yīng)面，從效應(yīng)面上選擇較佳的效應(yīng)區(qū)，從而反推出自變量的優(yōu)化取值范圍，即最佳試驗條件[8-9]。本試驗以五味子中的主要成分五味子醇甲和五味子酯甲的提取率為指標(biāo)，引入PB-CCD試驗設(shè)計方法，在優(yōu)化五味子水提工藝的同時，進(jìn)一步探討應(yīng)用于優(yōu)化中藥提取工藝的可行性。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜串聯(lián)AB SCIEX 4500 Qtrap 三重四級桿線性離子阱質(zhì)譜儀(美國Agilent公司，美國AB SCIEX公司)；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；GeneVac miVac 低溫離心濃縮儀(英國GeneVac公司)；Sartorius CPA225D 十萬分之一電子分析天平(德國賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 試藥

五味子醇甲、五味子酯甲(中國食品藥品檢驗研究所，批號分別為110857-201412，111529-200604)；乙腈為色譜純(Honeywell公司，批號分別為：DK268和364)；水為娃哈哈純化水；其余試劑均為分析純。

五味子購于陜西興盛德藥業(yè)有限責(zé)任公司，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)副教授劉世軍鑒定為木蘭科植物五味子Schisandrachinensis的干燥成熟果實。

2 方法與結(jié)果

2.1 PB-CCD五味子的水提工藝優(yōu)化

根據(jù)工業(yè)化大生產(chǎn)成本低、效果高的原則，選擇水回流法進(jìn)行提取。預(yù)試驗結(jié)果顯示，五味子水回流提取的影響因素有：浸泡時間、溶劑pH值、提取溫度、提取時間、提取次數(shù)、溶劑倍量及濃縮溫度。

2.1.1 Plackett-Burman試驗設(shè)計 為了在最少的試驗次數(shù)下獲得最佳的參數(shù)設(shè)置，選擇因子設(shè)計中的Plackett-Burman法作為篩選設(shè)計方法，見表1。

表1 影響因子及響應(yīng)因子設(shè)計表

表2 Plackett-Burman響應(yīng)因子設(shè)計與結(jié)果

2.1.2 設(shè)計結(jié)果與試驗結(jié)果 由表中數(shù)據(jù)得出，提取物中五味子醇甲含量與溶劑pH成正比，與濃縮溫度成反比；提取物中五味子酯甲含量與溶劑pH成反比，與浸泡時間成正比，與提取次數(shù)成正比。其中液固比、提取時間兩個因素對提取物中五味子醇甲及五味子酯甲含量無明顯影響。綜合分析pH、濃縮溫度、提取次數(shù)對模型有明顯的影響。pH、濃縮溫度和提取次數(shù)3個因素進(jìn)行優(yōu)化，其他因素(浸泡時間、提取時間、提取溫度、液固比)從最大值中選擇。根據(jù)各影響因子對各響應(yīng)因子的最大值運(yùn)算結(jié)果，將影響不顯著的因子進(jìn)行最大值預(yù)測，并作為固定條件：提取溫度40 ℃，液固比12 v·m-1，浸泡時間2 h，提取時間1 h。

2.1.3 Central Composite Design試驗設(shè)計 在PB設(shè)計結(jié)果的基礎(chǔ)上，對溶劑PH值、提取次數(shù)和濃縮溫度因素進(jìn)行尋優(yōu)。試驗采用通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(Rotatable=6)，根據(jù)PB-CCD的原理，每因素設(shè)五水平，用代碼值-α、-1、0、1、α表示(三因素星點設(shè)計的α=1.682)。代碼值所代表的實際操作物理量見表3，試驗安排與結(jié)果見表4。

表3 提取工藝影響因素星點設(shè)計水平

表4 試驗設(shè)計與結(jié)果

2.1.4 工藝參數(shù)優(yōu)化 五味子醇甲含量隨提取次數(shù)升高而升高；其他兩個變量pH值和濃縮溫度對五味子醇甲影響不顯著，見圖1。

注：A.五味子醇甲提取響應(yīng)曲面分析圖；B.五味子醇甲提取效果影響因素主效應(yīng)圖。圖1 提取次數(shù)與濃縮溫度對提取含量效應(yīng)面圖

五味子酯甲含量隨提取pH值升高而降低，濃縮溫度對五味子酯甲含量影響不顯著，在80 ℃時達(dá)到最低點，見圖2。

五味子醇甲及五味子酯甲在提取物中含量的3個影響因素(pH、提取次數(shù)、濃縮溫度)都隨著提取次數(shù)增加而增加，因此將次數(shù)增加為5次。最后選定條件為提取次數(shù)為5次，pH=5.0，濃縮溫度為60 ℃，見表5。

注：A.五味子酯甲提取響應(yīng)曲面分析圖；B.五味子酯甲提取效果影響因素主效應(yīng)圖。圖2 提取液PH值的效應(yīng)面圖

序號pH提取次數(shù)濃縮溫度/℃五味子醇甲峰面積五味子酯甲峰面積15 125 0060 00125920782742 725 145 0060 00125920982588 135 085 0060 00125921082959 345 195 0060 07125920982160 155 134 9960 00125685882672 765 644 9760 00125514079341 174 405 0060 00125920887431 685 225 0060 68125920881374 894 005 0060 49125920989533 0107 155 0060 00125920669403 2117 325 00100 00125920779111 3127 245 00100 00125920979647 2137 965 00100 00125917074910 2146 705 00100 00125920783157 3156 675 0078 81125920764315 3166 495 0082 68125920866751 3176 565 0082 93125920866395 5

2.2 含量測定

2.2.1 對照品溶液制備 分別取五味子醇甲對照品1 mg，五味子酯甲對照品1 mg，精密稱定，分別置10 mL容量瓶中，加甲醇3 mL超聲溶解，再加甲醇定容刻度，即得質(zhì)量濃度分別為0.11、0.1 mg·mL-1的五味子醇甲與五味子酯甲對照品儲備液。

2.2.2 樣品溶液制備 取五味子原藥材適量，經(jīng)烘干粉碎，過三號篩，取粉末3 g，精密稱定，置250 mL具塞三角瓶中，加pH值為5的溶劑36 mL(水溶液以鹽酸調(diào)至pH=5)，浸泡2 h，水浴加熱提取，水浴溫度70 ℃，提取5次，每次1 h。將5次所得提取液置于燒杯中，并將燒杯置于60 ℃的水浴鍋加熱濃縮，當(dāng)燒杯內(nèi)液體少于100 mL時轉(zhuǎn)移至100 mL蒸發(fā)皿內(nèi)繼續(xù)加熱，待溶劑蒸干后，再用水-乙腈(90∶10)溶液,邊洗滌邊轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，直至將蒸發(fā)皿內(nèi)殘渣完全洗凈，最后用水-乙腈(90∶10)溶液定容至刻度，搖勻，將提取液離心5 min (5000 r·min-1)，取上清液即得。0.22 μm濾膜過濾，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.2.3 分析條件 色譜柱：Waters SunfireTMC18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相A相為水，B相為乙腈，梯度洗脫，梯度洗脫程序：0～10 min：10%～90%B，10～13 min：90%B，13～15 min：90%～10%B；流速為0.8 mL·min-1；柱溫為25 ℃；進(jìn)樣量為5 μL。

質(zhì)譜采用ESI正離子模式進(jìn)行掃描，監(jiān)測模式為多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)。離子化參數(shù)：離子噴霧電壓5 500 v；霧化氣，輔助氣為氮氣，離子源噴霧溫度為650 ℃；輔助噴霧溫度為60 ℃，質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測參數(shù)見表6。

表6 五味子醇甲和五味子酯甲多反應(yīng)監(jiān)測參數(shù)

2.2.4 質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化 將單個標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)從標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋為0.1 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，對每個化合物進(jìn)行質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化，包括母離子和子離子、去簇電壓、入口電壓、碰撞池出口電壓、碰撞能量的確定。

在色譜條件和化合物質(zhì)譜參數(shù)確定的情況下，不接色譜柱，將混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液稀釋10倍，進(jìn)行自動質(zhì)譜離子化參數(shù)優(yōu)化，優(yōu)化參數(shù)有：噴霧電壓、霧化氣、輔助氣、輔助氣溫度、氣簾氣，優(yōu)化后測定樣品的總離子流圖，見圖3。

注：A.對照品混合物；B.五味子水提物；1.五味子醇甲(11.27 min)；2.五味子酯甲(12.81 min)。圖3 五味子提取物多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)測定成分提取總離子流圖

2.2.5 最低檢測限最低定量限 采用信噪比法，測得五味子混合標(biāo)準(zhǔn)品的檢測限(S/N=3)是5×10-5μg·mL-1，定量限(S/N=10)是1×10-4μg·mL-1。

2.2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取2.2.1項下對照品溶液五味子醇甲(0.11 mg·mL-1)和五味子酯甲(0.1 mg·mL-1)，將以上對照品溶液按梯度稀釋(500%、400%、200%、150%、120%、100%、80%、60%、40%)，以五味子醇甲進(jìn)樣濃度0.24、0.32、0.39、0.49、0.62、0.8 μg·mL-1為橫坐標(biāo)X，以LC-MS/MS出峰的峰面積為縱坐標(biāo)Y繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：Y= 7 400 000X+ 2 700 000，r=0.999 0。結(jié)果表明，五味子醇甲含量在0.24～0.8 μg·mL-1與峰面積呈良好的線性關(guān)系。以五味子酯甲進(jìn)樣濃度0.24、0.32、0.43、0.54、0.60、0.75、1.00 μg·mL-1為橫坐標(biāo)X，以LC-MS/MS出峰的峰面積為縱坐標(biāo)Y繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：Y=16 000 000X+ 2 380 000，r=0.999 5。結(jié)果表明，五味子酯甲含量在0.24～0.1 μg·mL-1與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2.7 方法學(xué)驗證 參照《中華人民共和國藥典》2015版一部對五味子藥材質(zhì)量控制方法的現(xiàn)行規(guī)定，對優(yōu)化結(jié)果進(jìn)行方法學(xué)驗證(精密度、重復(fù)性和樣品穩(wěn)定性)。

2.2.8 精密度試驗 選取2.2.6項中對照品溶液濃度梯度中的(80%、100%、120%)3個濃度的溶液，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣3次，進(jìn)行測定。結(jié)果3個濃度下峰面積RSD分別為：五味子醇甲0.75%～3.49%；五味子酯甲3.26%～4.59%。

2.2.9 重復(fù)性試驗 取五味子原藥材適量，按照2.2.2項樣品溶液的制備方法，制備6組，分別測定，每次進(jìn)樣5 μL，連續(xù)進(jìn)樣5次測定峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算五味子醇甲的RSD為1.64%，五味子酯甲的RSD為1.92%。

2.2.10 穩(wěn)定性試驗 取五味子原藥材適量，按照2.2.2項樣品溶液的制備方法，制備1組，0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣5 μL，測定峰面積，在0、2、4、8、12 h測得的峰面積相對穩(wěn)定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算五味子醇甲的RSD為2.02%，五味子酯甲的RSD為1.04%。結(jié)果表明，樣品在12 h內(nèi)穩(wěn)定,在12～24 h內(nèi)含量有顯著下降。

2.2.11 加樣回收試驗 精密吸取已知含量的提取液樣品0.5 mL，共6份，分別精密加入五味子醇甲及五味子酯甲對照品溶液，選取2.2.6項中對照品溶液濃度梯度中的(80%、100%、120%)3個濃度的溶液各0.5 mL，超聲混勻，吸取5 μL，注入色譜儀，測定。五味子醇甲的平均回收率為96.05%，RSD為3.06%；五味子酯甲的平均回收率96.41%，RSD為3.72%。

2.2.12 含量測定 取五味子原藥材適量，按照2.2.2項樣品溶液的制備方法，制備3組，分別測定，每次進(jìn)樣10 μL，測定峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算五味子醇甲的平均含量為0.22%，五味子酯甲的平均含量為0.02%。

3 討論

3.1 PB-CCD

Plackett-Burman實驗設(shè)計是常用的優(yōu)選主要影響因素方法，效應(yīng)面法(CCD)是近年來國外醫(yī)藥工作者常用的實驗設(shè)計和優(yōu)化法，通過描繪效應(yīng)對考察因素的效應(yīng)面，從效應(yīng)面上選擇較佳的效應(yīng)區(qū)，從而確定自變量取值范圍,即最佳實驗條件。

3.2 溶劑與流動相

在梯度洗脫中由于甲醇和分析物間氫鍵的相互作用，可能引入額外的共振結(jié)構(gòu)，并有可能引起拖尾峰。因此，選擇乙腈作為有機(jī)相。另外，溶劑pH值也是影響五味子中有效成分溶出的重要參數(shù)，在PB設(shè)計結(jié)果的基礎(chǔ)上一確定其數(shù)值為pH為5.0。對照品選用甲醇溶解。

4 結(jié)論

五味子藥理作用廣泛，臨床用于治療肝炎、神經(jīng)衰弱等疾病，療效顯著，是一種很有開發(fā)價值的中藥材。我國富產(chǎn)五味子，且其藥用歷史悠久，具有廣闊的應(yīng)用前景。隨著五味子化學(xué)成分和藥理活性的深入研究，對五味子的深加工提取工藝就有了更高的要求。由于水提工藝操作要求低、成本低，符合工業(yè)化大生產(chǎn)的要求。因此采用PB-CCD方法對五味子水提工藝進(jìn)行優(yōu)化，不但為五味子的質(zhì)量控制提供依據(jù)，也能推動五味子的市場開發(fā)和利用。

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ApplicationofPlackett-Burman-CentralCompositeDesignforExtractProcessingofSchisandrachinensisbyHPLC-MS/MS

WANGMei1，LIUMingming2，LIANGChenguang2，SHIXinbo2，BAIHongbo2,SONGZhongxing2，LIUYanru2，TANGZhishu2*

(1.TheAffiliatedHospitalofShaanxiUniversityofChineseMedicine，Shaanxi，Xianyang712000，China；2.ShaanxiUniversityofChineseMedicine/ShaanxiCollaborativeInnovationCenterofChineseMedicinalResourcesIndustrialization，ShaanxiprovincekeylaboratoryofnewdrugsandChinesemedicinefoundationresearch，Xianyang712083，Shaanxi，China)

Objective：A Plackett-Burman-Central Composite Design with response surface analysis method was applied to optimize the aqueous extraction efficiency ofSchisandrachinensismaterials.Method：By using design of experiments (DOEs)，the controllable factors of PB-CCD experiment were selected for further optimization，such as immersion time，liquid/solid ratio，pH value，extraction time，temperature and concentration based on schisandrin and schisantherin A determination.Results：An optimized condition of extraction was selected，2 hours of immersion time，1 hour of extraction time，70 ℃ of extraction temperature with five times under pH 5.0 of solvent and 60 ℃ of concentration temperature.Conclusion：The strategy of optimization method based on PB-CCD experiment design can apply a simple and reliable pathway for the aqueous extraction ofS.chinensis.

PB-CCD design；HPLC-MS/MS；Schisandrachinensis；schisandrin；schisantherin A

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.11.020

2015-12-10)

國家自然科學(xué)基金項目(81501229)；陜西省協(xié)同創(chuàng)新計劃項目(2015XT-35)；陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計劃項目(2011KTCL03-05)

*

唐志書，教授，研究方向：中藥新藥及新劑型開發(fā)；Tel：(029)38185060，Email：tzs6565@163.com