星點(diǎn)設(shè)計(jì)—效應(yīng)面法優(yōu)選芪天顆粒醇提工藝△

何承輝，劉宣麟，古麗斯坦·阿吾提，邢建國(guó)*，王巧梅

(1.新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所，新疆 烏魯木齊 830004；2.石河子大學(xué)，新疆 石河子 832000)

·中藥工業(yè)·

星點(diǎn)設(shè)計(jì)—效應(yīng)面法優(yōu)選芪天顆粒醇提工藝△

何承輝1，劉宣麟1，古麗斯坦·阿吾提1，邢建國(guó)1*，王巧梅2

(1.新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所，新疆 烏魯木齊 830004；2.石河子大學(xué)，新疆 石河子 832000)

目的：優(yōu)選芪天顆粒醇提最優(yōu)工藝。方法：采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)—效應(yīng)面法，以乙醇濃度、乙醇用量、提取時(shí)間為主要影響因素，芍藥苷、紅景天苷2種成分含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)對(duì)各因素的多元線性回歸及二項(xiàng)式擬合，采用效應(yīng)面法和等高線疊加優(yōu)選最佳提取工藝，并進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。結(jié)果：確定芪天顆粒醇提的最佳提取工藝為加10倍60%乙醇，提取2次，每次1.5 h。結(jié)論：星點(diǎn)設(shè)計(jì)—效應(yīng)面法優(yōu)選芪天顆粒醇提工藝，實(shí)際值與預(yù)測(cè)值吻合度高，預(yù)測(cè)性良好，方法簡(jiǎn)單易行，對(duì)工業(yè)生產(chǎn)有一定的意義。

星點(diǎn)設(shè)計(jì)；芪天顆粒；芍藥苷；紅景天苷；提取工藝；效應(yīng)面

芪天顆粒是在新疆一老中醫(yī)多年臨床常用湯劑的基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)研制的口服制劑，由黃芪、赤芍、紅景天等4味中藥組成，具有益氣活血、養(yǎng)心通脈、化瘀止痛之功能，在臨床用于氣虛血瘀所致的冠心病心絞痛。處方中黃芪含有皂苷類有效成分，赤芍中含有單萜及其苷類化合物，紅景天中含苷類成分，這些有效成分含有益氣行血、活血化瘀、通絡(luò)開(kāi)竅等藥理作用[1-3]。因此，根據(jù)各藥材有效部位和有效成分的理化性質(zhì)，對(duì)黃芪、赤芍、紅景天這3味藥材選用乙醇提取。在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)上采用了精度較高、預(yù)測(cè)性較好的星點(diǎn)設(shè)計(jì)，以2種苷類成分為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)分，繪制三維效應(yīng)曲面關(guān)系圖，采用等高線倆倆疊加的方式進(jìn)行優(yōu)化。本實(shí)驗(yàn)選用星點(diǎn)設(shè)計(jì)—效應(yīng)面法優(yōu)化芪天顆粒的醇提工藝，為其工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

SPD-10AVP型高效液相色譜儀(日本島津)；色譜分析柱Kromasil ODS(250 mm×4.6 mm，5 μm)；BS110S型電子天平(Sartoriμs)；Millipore simplicity-185超純水器(美國(guó)密理博公司)；KQ-100DE型數(shù)控超聲波發(fā)生器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥

芍藥苷、紅景天苷(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)分別為110818-201005，110818-201005，供含量測(cè)定用)；色譜甲醇(美國(guó)霍尼韋爾HoneywellB&J)；磷酸(上海化學(xué)試劑有限公司，分析純)。

黃芪、赤芍、紅景天均購(gòu)自于安徽省亳州市德昌藥業(yè)有限公司，經(jīng)新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所何江副研究員進(jìn)行鑒定，按照《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版各藥材項(xiàng)下規(guī)定檢驗(yàn)，均符合要求。

2 方法和結(jié)果

2.1 含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件 色譜柱Kromasil ODS柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇(A)-0.02%磷酸(B)，梯度洗脫：0～15 min，A∶B為19∶81；15～50 min,A∶B為19∶81～27∶73；50～60 min，A∶B為27∶73；檢測(cè)波長(zhǎng)：275 nm(紅景天苷，0～25 min)，230 nm(芍藥苷，26～60 min)；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.1.2 供試品溶液的制備 按照星點(diǎn)試驗(yàn)安排的設(shè)計(jì)編碼進(jìn)行試驗(yàn)，精密稱取黃芪、赤芍、紅景天飲片，加入適量乙醇，浸泡4 h后回流提取，合并濾液，濾液過(guò)濾定容，搖勻取樣，平行3次，將樣品稀釋，微孔濾膜(0.45μm)濾過(guò)，備用。

2.1.3 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取芍藥苷、紅景天苷對(duì)照品適量至容量瓶中，分別加甲醇溶解，制成每毫升含有紅景天苷0.506 mg、芍藥苷0.543 mg的混合對(duì)照品溶液。

2.1.4 線性關(guān)系考察 精密吸取混合對(duì)照 品溶液(紅景天苷506 μg·mL-1，芍藥苷543 μg·mL-1)2.0、3.0、4.0、5.0、7.0 mL，分別置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得紅景天、芍藥苷回歸方程分別為Y=3 164.7X-3 999.3 (r=0.999 8)；Y=2 884.6X+2 000.0 (r=0.999 8)。結(jié)果表明，紅景天苷在50.6～354.2 μg·mL-1、芍藥苷在54.3～380.1 μg·mL-1線性關(guān)系良好。

2.1.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取上述對(duì)照品溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，依法測(cè)定，結(jié)果芍藥苷、紅景天苷峰面積RSD分別為1.62%、1.09%，表明精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取星點(diǎn)試驗(yàn)下6號(hào)樣品儲(chǔ)備液，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，在0～12 h內(nèi)每2 h進(jìn)樣1次，按上述色譜條件測(cè)定。結(jié)果各成分峰面積RSD均小于5(n=6)，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.7 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取星點(diǎn)試驗(yàn)下6號(hào)樣品儲(chǔ)備液，計(jì)算加入等量待測(cè)物質(zhì)的對(duì)照品溶液，按上述色譜條件下測(cè)定，計(jì)算芍藥苷和紅景天苷的加樣回收率。結(jié)果平均回收率均在95%～105%，RSD均小于5(n=6)。

2.2 星點(diǎn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)

2.2.1 因素、水平及指標(biāo)的確定 影響醇提工藝主要因素有乙醇濃度(X1)、乙醇用量(X2)、提取時(shí)間(X3)、提取次數(shù)、藥材粒度，由于提取次數(shù)、藥材粒度為非連續(xù)性變量，不能進(jìn)行回歸處理，結(jié)合預(yù)試驗(yàn)單因素考察結(jié)果及工業(yè)生產(chǎn)實(shí)際，確定提取次數(shù)為2次，藥材粒度為中藥飲片；其余因素、水平見(jiàn)表1。

表1 星點(diǎn)設(shè)計(jì)因素與水平

2.2.2 試驗(yàn)安排與指標(biāo)測(cè)定 按星點(diǎn)設(shè)計(jì)3因素設(shè)計(jì)試驗(yàn)，按2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，以總皂苷含量、芍藥苷含量、紅景天苷含量、浸出物量綜合評(píng)分為考察指標(biāo)，星點(diǎn)試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 星點(diǎn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.2.3 結(jié)果分析 指標(biāo)權(quán)重的確定：以總皂苷含量、紅景天苷含量、芍藥苷含量和浸出物量為指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)(權(quán)重系數(shù)分別為0.3、0.3、0.3、0.1)。

綜合評(píng)分=(總皂苷含量/最大總皂苷含量)×30%+(紅景天苷含量/最大紅景天苷含量)×30%+(芍藥苷含量/最大芍藥苷含量)×30%+(醇浸出物得率/最大醇浸出物得率)×10%

模型擬合：采用Design-Expert8.0.5b軟件對(duì)綜合評(píng)分進(jìn)行多元線性回歸，結(jié)果r=0.058 5，相關(guān)系數(shù)較低，擬合度不佳，預(yù)測(cè)性較差，因此線性模型不適合，故采用二項(xiàng)式擬合，得到回歸方程：Y=-366.914 45+13.593 23X1+1.282 1X2+24.345 8X3+0.050 735X1X2-0.217 08X1X3-0.972 27X2X3-0.107 24X12-0.151 06X22-0.136 97X32(r=0.972 0)，比較線性回歸與二次多項(xiàng)式擬合的結(jié)果可知，二次多項(xiàng)式表現(xiàn)出更好的相關(guān)性。

方差分析：采用ANOVA分析效應(yīng)面的回歸參數(shù)，方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 二項(xiàng)式模型及方差分析

方差分析結(jié)果顯示，該二項(xiàng)式擬合模型F值為38.51，P﹤0.000 1，表明建立的模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；確定系數(shù)Radj2為0.946 7，說(shuō)明方程的因變量與全體自變量之間的線性關(guān)系是顯著的，響應(yīng)值的變化有94.67%來(lái)源于本研究所選定的自變量。模型的變異系數(shù)為0.88%，說(shuō)明該模型的精度很好。同時(shí)，方程的失擬項(xiàng)不顯著，回歸方程在整個(gè)回歸區(qū)域內(nèi)擬合情況良好，可用該回歸模型代替真實(shí)試驗(yàn)點(diǎn)對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。表3顯示，各因素對(duì)響應(yīng)值作用的顯著性排序?yàn)閄1>X2>X3。二次項(xiàng)X12對(duì)指標(biāo)影響顯著。以上結(jié)果印證了芪天顆粒提取模型中各因素對(duì)考察指標(biāo)的影響并不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。

等高線圖和效應(yīng)面圖分析：對(duì)擬合的模型進(jìn)行適合性檢驗(yàn)，以通過(guò)檢驗(yàn)的合適的數(shù)學(xué)模型為基礎(chǔ)，描繪三維效應(yīng)面，由于三維效應(yīng)面只能表達(dá)含2個(gè)自變量函數(shù)的曲面圖，因此固定3個(gè)自變量中的1個(gè)，并設(shè)其值為中值，代入原方程，應(yīng)用Design-Expert8.0.5b統(tǒng)計(jì)軟件繪制三維曲面圖及等高線圖，見(jiàn)圖1～3。從圖中還可以看出，每個(gè)效應(yīng)面都具有各自的較優(yōu)區(qū)域，通過(guò)效應(yīng)面圖及等高線疊加區(qū)域，得出較佳工藝范圍為X1：59.05%～70.95%；X2：8.81倍～11.19倍；X3：1.20～1.80 h；結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)條件，最終確定工藝為加10倍60%乙醇，提取2次，每次1.5 h。

圖1 乙醇用量、乙醇濃度及其相互作用對(duì)提取 工藝影響的響應(yīng)面

圖2 提取時(shí)間、乙醇濃度及其相互作用對(duì)提取 工藝影響的響應(yīng)面

圖3 提取時(shí)間、乙醇用量及其相互作用對(duì)提取 工藝影響的響應(yīng)面

驗(yàn)證試驗(yàn)：根據(jù)最優(yōu)工藝制備3批樣品，測(cè)定其總皂苷、芍藥苷、紅景天苷含量和浸出物量，結(jié)果總皂苷平均含量為26.16 mg·g-1、芍藥苷平均含量為30.67 mg·g-1、紅景天苷平均含量為9.58 mg·g-1，醇浸出物量29.81%，總評(píng)歸一值0.921 3，預(yù)測(cè)值0.915 8，偏差率為-0.60%，說(shuō)明本試驗(yàn)建立的數(shù)學(xué)模型可靠，具有良好的預(yù)測(cè)性。

3 討論

目前國(guó)內(nèi)中藥提取工藝優(yōu)化的相關(guān)報(bào)道多采用正交設(shè)計(jì)法，是采用線性模型。正交設(shè)計(jì)法具有試驗(yàn)次數(shù)少、簡(jiǎn)單方便等優(yōu)點(diǎn)，但是，也有其缺點(diǎn)，即沒(méi)有直觀圖形，無(wú)法直觀判別優(yōu)化區(qū)域，因此，預(yù)測(cè)性較差。星點(diǎn)設(shè)計(jì)—效應(yīng)面法是近年來(lái)在優(yōu)化中藥提取工藝方面應(yīng)用十分廣泛的一種方法[4-6]。適用于非線性擬合，具有實(shí)驗(yàn)次數(shù)少、精密度高、預(yù)測(cè)性好等優(yōu)點(diǎn)[7]。本實(shí)驗(yàn)在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)—效應(yīng)面法優(yōu)選工藝，其結(jié)果更具可靠性。以擬合的二次方程為模型，得出總評(píng)OD值的預(yù)測(cè)值為0.213，經(jīng)過(guò)3次驗(yàn)證試驗(yàn)，得到總評(píng)OD值的平均值為0.915 8，偏差率為-0.60%，表明星點(diǎn)設(shè)計(jì)—效應(yīng)面法優(yōu)化本方的工藝預(yù)測(cè)性較好。

筆者以多指標(biāo)成分綜合評(píng)分作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，優(yōu)化了芪天顆粒醇提工藝。最終確定醇提最佳工藝：10倍60%乙醇，提取2次，每次1.5 h。分析結(jié)果得乙醇濃度、乙醇用量和提取時(shí)間對(duì)綜合評(píng)分有不同程度的影響，其中乙醇濃度影響最顯著，各因素間存在不同程度的交互作用。星點(diǎn)設(shè)計(jì)的理論優(yōu)化結(jié)果與試驗(yàn)值差異小，采用非線性擬合模型接近客觀事實(shí)，效應(yīng)面三維圖使因素對(duì)指標(biāo)的影響更為直觀、方便，精度高。本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化出了本方醇提的最佳工藝，為下一步的制劑成型奠定了基礎(chǔ)。

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OptimizationofAlcoholExtractingProcessBasedonCentralCompositeDesignandResponseSurfaceMethodologyforQitianGranules

HE Chenghui1，LIU Xuanlin1，Gulisitan·AWUTI1，XING Jianguo1*，WANG Qiaomei2

(1.XinjiangInstituteofMateriaMedica，Urumqi830004，China；2.ShiheziUniversity，Shihezi832000，China)

Objective：To optimize the alcohol extraction process for Qitian Granules by central composite design and response surface methodology.Methods：Central composite design and response surface methodology were used to optimize the alcohol extracting process.The main influentia1 factors of extraction efficiency were ethanol concentration，reflux time，and solvent ratio.The conditions of the extraction were evaluated by the two compositions of paeoniflorin and salidroside.Multiple linear regression and binomial fitting models were performed with the main influential factors.Response surface and superposition of contour line were used to optimize the process and to predict the response in the optimal region.Results：The analysis indicated the optimum conditions of the extracting were 60% ethanol，10 fold solvent，extracting for 2 times and for 1.5 h.Conclusion：It shows that the optimum process for extracting is simple，more convenient and with an higher precision，which is significant to industry production.

Central composite design；Qitian Granules；paeoniflorin；salidroside；extraction process；response surface

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.10.019

2016-01-22)

新疆地產(chǎn)中藥民族藥新藥研發(fā)項(xiàng)目(Q2015-01-03)

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邢建國(guó)，研究員，研究方向：中藥制劑研究；Tel：(0991)2300682，E-mail：xjguodd@163.com