葛花、枳椇子配伍對慢性酒精性肝損傷大鼠海馬7種單胺類神經遞質及代謝產物含量水平的影響△

王旭，陳紹紅，鐘贛生*，柳海艷，王茜，劉明，趙桐，于雪，范盎然，張傲哲

(1.北京中醫藥大學 基礎醫學院，北京 100029；2.河北中醫學院，河北 石家莊 050200)

葛花、枳椇子配伍對慢性酒精性肝損傷大鼠海馬7種單胺類神經遞質及代謝產物含量水平的影響△

王旭1，陳紹紅1，鐘贛生1*，柳海艷1，王茜2，劉明1，趙桐1，于雪1，范盎然1，張傲哲1

(1.北京中醫藥大學 基礎醫學院，北京 100029；2.河北中醫學院，河北 石家莊 050200)

目的：從配伍劑量、給藥周期兩個角度，探討葛花、枳椇子配伍對慢性酒精性肝損傷大鼠海馬7種單胺類神經遞質及代謝產物含量的影響。方法：采用白酒灌胃的方法復制慢性酒精性肝損傷大鼠模型，將Wistar大鼠隨機分為空白組、模型組、東寶甘泰組、葛花枳椇子配伍組(低、中、高劑量)，分別于灌胃4、8、12周后，冰上快速剝取海馬組織，利用高效液相-電化學方法檢測大鼠海馬單胺類神經遞質及其代謝產物的含量。結果：造模4周后，與模型組相比，5-羥色胺(5-HT)的含量在配伍的3個劑量組有統計學差異；去甲腎上腺素(NE)的含量在配伍中、高劑量組有統計學差異；高香草酸和腎上腺素的含量在配伍中劑量組有統計學差異。造模8周后，與模型組相比，5-HT的含量在配伍的3個劑量組有統計學差異；5-羥吲哚乙酸(5-HIAA)的含量在配伍中、高劑量組有統計學差異；多巴胺的含量在配伍中劑量組有統計學差異。造模12周后，與模型組相比，5-HIAA的含量在配伍低、高劑量組有統計學差異；NE的含量在配伍中劑量組有統計學差異。結論：葛花、枳椇子配伍對慢性酒精性肝損傷模型大鼠海馬單胺類神經遞質及代謝產物含量有一定的調節作用，為葛花、枳椇子配伍防治酒精性相關疾病的研究提供了數據支撐。

葛花；枳椇子；配伍；單胺類神經遞質；慢性酒精性肝損傷

葛花和枳椇子在古代即是解酒的常用中藥，明代《滇南本草》中記載葛花：“治頭暈，憎寒壯熱。解酒醒脾，治酒毒酒痢，飲食不思，胸膈飽脹發呃，嘔吐酸痰，酒毒傷胃，吐血嘔血。消熱，解酒毒[1]。”清代《本經逢原》中記載枳椇“木能敗酒，屋外有此木，屋內釀酒皆不佳，丹溪治酒病，往往用其實[2]。”課題組前期對急性酒精中毒動物模型的研究，明確了葛花和枳椇子的解酒保肝作用[3-4]。之后又進行了葛花、枳椇子不同比例配伍對慢性酒精性肝損傷大鼠模型的研究，結果表明葛花、枳椇子以2∶1比例配伍時在肝損傷方面有更好的防治作用[5]。本實驗主要是在慢性酒精性肝損傷大鼠模型的基礎上，從配伍劑量、給藥周期兩個角度探討葛花、枳椇子配伍對慢性酒精性肝損傷模型大鼠海馬單胺類神經遞質及代謝產物的量-時-效關系，因有研究報道，長期酒精攝入可對中樞神經系統產生損傷，其機制可能是酒精影響中樞某些神經遞質的含量及其受體的活性，因此本文同時觀察了葛花、枳椇子以2∶1比例配伍后對大鼠海馬單胺類神經遞質含量水平的影響，以期為葛花、枳椇子防治酒精性相關疾病的研究提供依據。

1 材料

1.1 動物

雄性Wistar大鼠，體重180～200 g(北京維通利華實驗動物技術有限公司)，許可證編號：SCXK(京)2012-0001。

1.2 藥物

葛花為豆科植物葛Puerarialobata(Willd.)Ohwi的花，枳椇子為鼠李科植物枳椇HoveniaacerbaLindl.干燥成熟帶肉質果柄的果實或種子，購自北京本草方源藥業有限公司，批號分別為20120722、20120729。東寶肝泰片(通化東寶藥業股份有限公司，批號：121109)。

葛花、枳椇子藥液制備：將葛花、枳椇子按2∶1的比例混合浸泡0.5 h，第一次加10倍量水煎煮提取1.5 h，第二次加8倍量水煎煮提取1 h。濾過，合并濾液，濃縮至一定濃度。使用時，加0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC)配制成所需濃度的藥液，給藥體積為10 mL·kg-1。東寶肝泰藥液配制：使用時用0.5% CMC配成0.036 g·mL-1濃度的藥液，給藥體積為10 mL·kg-1。

1.3 試劑

56°紅星二鍋頭酒(北京紅星釀酒股份有限公司)。

單胺類神經遞質對照品：5-羥色胺(5-HT)、5-羥吲哚乙酸(5-HIAA)、多巴胺(DA)、3，4-二羥基苯乙酸(DOPAC)、高香草酸(HVA)、去甲腎上腺素(NE)、腎上腺素(E)，均購自美國Sigma公司。

內標：3，4-二羥芐胺(DHBA，美國Sigma公司)。

色譜級甲醇(fisher)、L-半胱氨酸(amresco)、磷酸二氫鈉(merck)、辛烷磺酸鈉(Alfa)、乙二胺四乙酸二鈉(Alfa)、氯化鉀(Alfa)均為進口分析純。

1.4 儀器

Agilent 1100LC型高效液相色譜儀(美國Agilent)，包括G1379A型脫氣機、G1311A型色譜泵、G1313A型自動進樣器、G1316A型柱溫箱；DECADEⅡSDC型電化學檢測器(荷蘭ANTEC公司)，包括玻璃碳工作電極、Ag/AgCl參比電極、工作站(Clarity CHS)；Biofuge Stratos高速冷凍離心機(德國HERAEUS)；VCX130型超聲破碎儀(美國SONICS)。

2 方法

2.1 模型復制

大鼠正常喂養一周后開始造模，用56°紅星二鍋頭酒灌胃，第1周每天給酒8 mL·kg-1，1次灌胃，連續2周；第3周每天給酒10 mL·kg-1，以后每周稱重，根據體重計算給酒量，分別連續4、8、12周。以肝功能指標及病理形態學檢驗慢性酒精性肝損傷模型是否復制成功。

2.2 實驗分組及給藥方法

Wistar大鼠隨機分成6組：空白組、模型組、東寶肝泰組、配伍低劑量組(生藥3 g·kg-1)、配伍中劑量組(生藥6 g·kg-1)、配伍高劑量組(生藥12 g·kg-1)。空白組給予0.5% CMC灌胃，灌胃體積為10 mL·kg-1，其余各組給予白酒灌胃(給酒方法見模型復制)，配伍各劑量組每日上午先給予相應濃度的藥液，給藥體積為10 mL·kg-1，下午給予白酒灌胃(給酒方法同2.1)。

2.3 樣本處理

分別于實驗第4、8、12周，末次給藥后，于晚10點禁食12 h，次日灌酒1 h后，將動物快速斷頭，取腦，置于冰上剝離所要組織部位。稱重加入組織裂解液(0.2 mol·L-1高氯酸，0.01%L-半胱氨酸，0.5 mmol·L-1EDTA二鈉)，每10 mg組織加入50 μL裂解液，冰浴超聲破碎10 s。離心30 min、4 ℃、15 000 r·min-1，取上清液-80℃凍存以析出蛋白，檢測前再以15 000 r·min-1離心30 min，取上清液用0.22 μm耐酸過濾器過濾，取20 μL檢測。待檢海馬單胺類神經遞質NE、E、DA、5-HT，及代謝產物DOPAC、HVA、5-HIAA。各神經遞質含量以ng·g-1腦組織濕重表示。

2.4 檢測條件

2.4.1 色譜條件 固定相：Skyam?C18柱(100 mm×2.1 mm，3 μm)；流動相：磷酸二氫鈉100 mmol·L-1，辛烷磺酸鈉0.74 mmol·L-1，乙二胺四乙酸鈉0.027 mmol·L-1，氯化鉀8 mmol·L-1，甲醇8%，pH值為3；流速：0.2 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL；測定電極電勢：500 mV。各對照品及大鼠海馬組織的分離圖譜見圖1、圖2。

注：1.NE；2.E；3.DHBA；4.DOPAC；5.DA；6.5-HIAA；7.HVA；8.5-HT；下同。圖1 各對照品分離圖譜

圖2 大鼠海馬組織的分離圖譜

2.4.2 標準曲線 以峰面積為縱坐標(Y)，NE、E、DA、5-HT、DOPAC、HVA、5-HIAA的質量濃度為橫坐標(mg·L-1)，繪制標準曲線。NE在0.011 8～1.516 0 mg·L-1線性良好，回歸方程為Y=863.01X；E在0.015 3～1.960 0 mg·L-1線性良好，回歸方程為Y=689.96X；DOPAC在0.000 6～0.160 0 mg·L-1線性良好，回歸方程為Y=775.96X；DA在0.002 5～0.637 5 mg·L-1線性良好，回歸方程為Y=300.61X；5-HIAA在0.000 7～0.176 4 mg·L-1線性良好，回歸方程為Y=1 099.03X；HVA在0.048 8～1.560 0 mg·L-1線性良好，回歸方程為Y=59.31X；5-HT在0.010 8～0.345 0 mg·L-1線性良好，回歸方程為Y=690.98X，r=0.999 9。

2.5 統計方法

3 結果

3.1 造模4周后葛花、枳椇子配伍對慢性酒精性肝損傷大鼠海馬單胺類神經遞質含量的影響

由表1可知，對于5-HT的含量變化，配伍的3個劑量組與模型組相比均有統計學差異；對于HVA的含量變化，配伍中劑量組與模型組相比有統計學差異；對于NE的含量變化，配伍中、高劑量組與模型組相比有統計學差異；對于E的含量變化，配伍中劑量組與模型組相比有統計學差異。

3.2 造模8周后葛花、枳椇子配伍對慢性酒精性肝損傷大鼠海馬單胺類神經遞質含量的影響

由表2可知，對于5-HT的含量變化，模型組與空白組相比有統計學差異，配伍的3個劑量組與模型組相比有統計學差異；對于5-HIAA的含量變化，模型組與空白組相比有統計學差異，配伍中、高劑量組和東寶肝泰組與模型組相比有統計學差異；對于DA的含量變化，配伍中劑量組與模型組相比有統計學差異；對于E的含量變化，東寶肝泰組與模型組相比有統計學差異。

3.3 造模12周后葛花、枳椇子配伍對慢性酒精性肝損傷大鼠海馬單胺類神經遞質含量的影響

由表3可知，對于5-HIAA的含量變化，配伍低、高劑量組與模型組相比有統計學差異；對于NE的含量變化，配伍中劑量組與模型組相比有統計學差異。

表1 造模4周后葛花、枳椇子配伍對慢性酒精性肝損傷大鼠海馬單胺類神經遞質含量的影響 /ng·g-1

注：與空白組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05；下同。

表2 造模8周后葛花、枳椇子配伍對慢性酒精性肝損傷大鼠海馬單胺類神經遞質含量的影響 /ng·g-1

表3 造模12周后葛花、枳椇子配伍對慢性酒精性肝損傷大鼠海馬單胺類神經遞質含量的影響 /ng·g-1

4 討論

現代社會酒精濫用情況日漸嚴重，酒精屬親脂性小分子化學物質，飲酒后，酒精能迅速進入血液循環而分布全身，對神經系統和肝臟的損害最為嚴重。在臨床，酒精所致精神障礙合并酒精性肝損傷已是最常見的病種之一。

單胺類神經遞質包括兒茶酚胺(CA)和5-HT兩大類，CA又包括DA、NE和E。DA分解產生DOPAC和HVA，5-HT分解產生5-HIAA[6]。有研究顯示，長期或大量飲酒者的CT掃描顯示一定程度的腦萎縮[7]，酒精的攝入可以影響神經傳遞物質(如多巴胺、去甲腎上腺素、γ-氨基丁酸、血清素等)的代謝，從而導致挑釁行為和暴力事件的發生[8]。海馬的功能意義主要是學習記憶方面，海馬結構中已被確認的神經遞質不下十幾種，其中分布較廣泛、研究較多的是單胺類神經遞質。海馬中單胺類神經遞質含量的變化可能是酒精致學習記憶障礙和精神障礙的機制之一。

5-HT屬吲哚胺類遞質，與情感障礙密切相關，5-HIAA是其代謝產物。楊牧祥等[9]研究顯示，酒精中毒小鼠腦中5-HT含量較正常組顯著升高。本研究結果與上述研究一致，采用56°酒精灌胃造模4周后，模型組大鼠海馬中5-HT含量較空白組就有升高趨勢，8周后就有顯著升高，說明酒精可干擾5-HT的代謝。5-HT進入胞漿后，被線粒體表面的單胺氧化酶(MAO)氧化脫氨，首先生成5-羥吲哚乙醛，然后被醛脫氫酶作用生成5-HIAA，這是5-HT代謝最主要的途徑[6]。有研究顯示，乙醇的初級代謝產物乙醛可抑制醛脫氫酶(ALDH)的活性[10]，另有研究發現酒精暴露可顯著抑制胎鼠腦中MAO的活性[11]，這兩種酶活性的抑制都可致5-HT含量升高。按照上述分析，酶活性的抑制應該導致代謝產物5-HIAA含量的降低，而本實驗的結果卻顯示，造模8周后模型組大鼠海馬中5-HIAA含量較空白組顯著升高，造模12周后仍有升高趨勢。毛健等[11]研究也顯示，經過4.0 g·kg-1酒精處理后，胎鼠全腦中5-HIAA含量顯著降低，也與本實驗的結果不一致。因5-HIAA是5-HT無活性的代謝終產物，最終會隨尿液排出體外，目前對其進行的研究較少，但5-HIAA的含量變化能夠在一定程度上反映5-HT的代謝情況。

DA屬兒茶酚胺類遞質，與精神活動密切相關，DOPAC、HVA是其代謝產物。酒精可直接作用神經元細胞膜上的多巴胺D2受體，對多巴胺系統有興奮作用，引起DA能神經元釋放DA增多[12]。項翠琴等[13]研究也顯示，乙醇可使大鼠腦中DA含量升高，且呈劑量效應關系，乙醇低劑量組(25.6%)的DA和DOPAC含量均顯著升高。本研究采用56°酒精灌胃造模后，除造模4周末的HVA含量外，其余模型組大鼠海馬中DA、DOPAC和HVA含量較空白組均有升高趨勢，但差異無統計學意義。分析原因有以下可能，一是酒精對神經元尚未造成明顯的病理損傷；二是DA有負反饋調節，為保持腦內DA能神經回路內環境的恒定，抑制DA的合成；三是酒精對DA能系統的影響不是單一的，可能對DA的合成、釋放和滅活等多方面有影響。在本實驗中，我們認為第三種可能性比較大，在酒精的作用下，中樞中DA的代謝情況可能較復雜。

NE和E屬兒茶酚胺類遞質，DA經多巴胺β羥化酶(DβH)作用生成NE，NE在苯乙醇胺-N-甲基轉移酶(PNMT)作用下甲基化合成E[6]。去甲腎上腺素能神經元(NEn)主要位于腦橋和延髓，其中藍斑核占NEn總數的一半[6]。有研究表明，酒精中毒者藍斑核中去甲腎上腺素能神經元數目減少，密度下降，腦脊液中NE的濃度下降[14]，按照以上分析，NE濃度的下降會導致E濃度的下降。本研究采用56°酒精灌胃造模4、8、12周后，模型組大鼠海馬中NE的含量較空白組有降低趨勢，但差異無統計學意義。分析原因有以下可能，一是酒精對神經元尚未造成明顯的病理損傷；二是因為NE、E的合成和代謝過程受到MAO、兒茶酚-O-甲基轉移酶(COMT)、DβH、ALDH和PNMT等眾多酶的影響，其過程較復雜，還需要進一步的實驗研究。

本研究還發現，造模4周后，與模型組相比，葛花、枳椇子配伍低劑量組的5-HT，配伍中劑量組的5-HT、HVA、NE和E，配伍高劑量組的5-HT、NE的含量變化有統計學差異；造模8周后，與模型組相比，葛花、枳椇子配伍低劑量組的5-HT，配伍中劑量組的5-HT、5-HIAA和DA，配伍高劑量組的5-HT、5-HIAA的含量變化有統計學差異；造模12周后，與模型組相比，葛花、枳椇子配伍低劑量組的5-HIAA，配伍中劑量組的NE，配伍高劑量組的5-HIAA的含量變化有統計學差異；說明葛花、枳椇子配伍對慢性酒精性肝損傷模型大鼠海馬中的5-HT、5-HIAA、DA、HVA、NE和E的含量有調節作用。另外，與模型組相比，造模8周后，東寶甘泰組的5-HIAA和E的含量變化有統計學差異，說明東寶甘泰片對慢性酒精性肝損傷模型大鼠海馬的5-HIAA和E的含量有調節作用。東寶甘泰片是臨床上治療脂肪肝、肝硬化和急、慢性肝炎的首選藥，為此本實驗將東寶甘泰片作為陽性對照藥物，本研究發現東寶甘泰片除了對肝損傷的臨床療效，對中樞海馬中的單胺類神經遞質含量也有一定的調節作用。

本實驗在慢性酒精性肝損傷模型的基礎上探討中樞單胺類神經遞質含量的變化，可以為研究葛花、枳椇子配伍對酒精性腦損傷的研究奠定基礎，并為臨床應用葛花、枳椇子防治酒精性相關疾病提供依據。研究提示葛花、枳椇子配伍對慢性酒精中毒患者的學習記憶障礙和精神障礙有改善作用。

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EffectivenessofCompatibilityofFlosPuerariaeLobataeandSemenHoveniaeon7KindsMonoamineNeurotransmittersandTheirMetabolitesinHippocampalTissueofRatswithChronicAlcoholicLiverInjury

WANG Xu1，CHENShaohong1，ZHONGGansheng1*，LIUHaiyan1，WANGXi2，LIUMing1，ZHAOTong1，YUXue1，FANAngran1，ZHANGAozhe1

(1.CollegeofPreclinicalMedicine，BeijingUniversityofChineseMedicine，Beijing100029，China；2.HebeiUniversityofChineseMedicine，Hebei050200，China)

Objective：To examine the effectiveness of compatibility of Flos Puerariae Lobatae and Semen Hoveniae on 7 kinds of monoamine neurotransmitters and their metabolites in hippocampal tissue of rats with chronic alcoholic liver injury from two aspects-the compatibility dosage and dosing cycle.Methods：The rats model with chronic alcoholic liver injury were induced by administrating wine. The rats randomly divided into blank control group，model group， positive control group，and compatibility groups with dose difference (low，medium and high doses). After 4，8 and 12 weeks, hippocampus were rapidly removed and frozen immediately. HPLC-ECD was used to test the expression of monoamine neurotransmitters and their metabolites of hippocampal tissue in rats.Results：After 4 weeks，in comparison to model group，the content of 5-HT in the three compatibility doses groups were changed with statistically significant. The content of NE in the medium and high doses group were changed with statistically significant. The content change of HVA and E in the medium dose group were changed with statistically significant. After 8 weeks，In comparison to model group，the content of 5-HT in the three compatibility doses groups were changed with statistically significant. The content of 5-HIAA in the medium and high doses group were changed with statistically significant；the content change of DA in the medium dose group were changed with statistically significant. After 12 weeks，In comparison to model group，the content of 5-HIAA in the low and high doses group were changed with statistically significant. The content change of NE in the medium dose group were changed with statistically significant.Conclusion：Compatibility of Flos Puerariae Lobatae and Semen Hoveniae could affect the expression of monoamine neurotransmitters and their metabolites in hippocampal tissue of rats with chronic alcoholic liver injury.

Flos Puerariae Lobatae; Semen Hoveniae; compatibility；monoamine neurotransmitter；alcoholic liver injury

2015-06-07)

國家自然科學基金(81274104)

*

鐘贛生，教授，研究方向：中藥基礎理論；Tel：(010)64287006，E-mail：zhonggansheng@sohu.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.5.004