表沒食子兒茶素沒食子酸酯對大鼠腎草酸鈣結石模型成石的影響

湯春波，周永，陳偉，高文波，吳齊全，周酉楓，齊勇

表沒食子兒茶素沒食子酸酯對大鼠腎草酸鈣結石模型成石的影響

湯春波，周永，陳偉，高文波，吳齊全，周酉楓，齊勇

目的觀察不同劑量表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）對大鼠腎結石模型成石的影響。方法50只雄性SD大鼠分為5組，A組為空白對照組；B組為單純成石組，采用1%乙二醇及2%氯化銨進行配制成的造石液2ml灌胃；C、D及E組均為EGCG干預組，分別在B組處理方法的基礎上每天予10、30及50 mg/kg的0.1%EGCG溶液灌胃處理；均連續進行28 d。取右腎組織測定丙二醛（MDA）、過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）水平；左腎冰凍切片，偏光顯微鏡觀察結晶情況。結果B組較A組腎組織MDA濃度顯著增高，而SOD、GSH-Px、CAT濃度顯著降低（均＜0.01）。與B組比較，C、D及E組腎組織MDA水平降低及SOD水平增加（均＜0.01）。腎組織結晶與EGCG治療劑量呈負相關（=―0.483，＜0.01）。結論過氧化損傷是導致高草酸誘導的腎小管上皮細胞損傷的主要機制和結石形成的主要途徑；EGCG可減輕機體的過氧化損傷，降低形成腎結石的危險性。

泌尿系統結石；表沒食子兒茶素沒食子酸酯；大鼠

泌尿系統結石是常見病，且治療后復發率居高不下。據報道，男性泌尿系統結石復發率為70%～80%，女性為47%～60%，其復發率高的原因主要是未對結石病因進行有效的治療。在泌尿系結石中，草酸鈣是最常見的類型，多項研究表明其與自由基過度產生及氧化應激損傷是導致草酸鈣結石發生的重要原因［1］，而表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）具有較強的抗氧化生物學活性。本研究以乙二醇聯合氯化銨制作大鼠草酸鈣腎結石模型，并用不同劑量EGCG進行干預，觀察腎組織中的結晶沉積情況，同時檢測腎組織內丙二醛（MDA）、抗氧化酶濃度，以更進一步探討草酸鈣腎結石形成機制及尋求抑制其形成的方法。報道如下。

1　資料與方法

1.1動物及分組雄性SD大鼠50只，體質量190～210 g，由浙江大學動物實驗中心提供。進行1周的適應性飼養后隨機分為5組。A組為空白對照組，繼續使用標準常規飼料及純凈水飼養；B組為單純成石組，采用1%乙二醇及2%氯化銨進行配制成的造石液2 ml灌胃；C組為低劑量EGCG干預組，在B組處理方法的基礎上每天予 10 mg/kg的0.1%EGCG溶液灌胃處理；D組為中劑量EGCG干預組，在B組處理方法的基礎上每天予30 mg/kg的0.1%EGCG溶液灌胃處理；E組為高劑量EGCG干預組，在B組處理方法的基礎上每天予50 mg/kg的0.1%EGCG溶液灌胃處理；均連續進行28 d。

1.2檢測指標與方法采用過量 10%水合氯醛腹腔注射處死大鼠，將大鼠處死后剖開腹腔暴露腎臟，小心鉗夾并取出雙側腎臟，左側腎臟以10%中性甲醛溶液固定，經過脫水、透明以及石蠟包埋等過程后，制成厚度為4 m的腎臟組織切片進行HE染色，在光學顯微鏡下對腎臟組織進行觀察。主要觀察對象為游離結石、結晶沉淀物以及鈣化斑等病理改變，可根據以下標準對草酸鈣結石嚴重程度進行觀察：腎皮質、髓質及腎乳頭形態結構正常，未見顯著的結晶沉淀物及腎結石計0分；腎臟皮質及髓質內可見散在的、少量的結晶沉淀計1分；腎盂、腎皮質以及髓質內可見明顯的游離結晶以及結晶沉淀物計2分；可見腎盂擴張積水、腎乳頭部位可見鈣化斑、腎皮質及髓質內可見較多結晶計3分；腎盂明顯擴張積水、腎乳頭部位可見鈣化斑、腎皮質及髓質內可見大量結晶并伴有游離結石形成計4分。總分為各結晶等級×相對應的結晶結果數目之和。

取右側腎臟以玻璃勻漿器經精細研磨后，制備組織制成勻漿。用硫代巴比妥酸（TBA）法測定丙二醛（MDA）含量：MDA可與TBA化合呈粉紅顯色反應，測其吸光度A值，以四乙氧基丙烷作為標準品，可推算出MDA含量；用黃嘌呤氧化酶法檢測超氧化物歧化酶（SOD）活性：黃嘌呤在黃嘌呤氧化酶作用下可生成O2－，SOD可催化O2－與H+反應生成H2O2，通過測定管與對照管比較吸光度，計算出樣品中SOD活性；采用紫外分光光度法測定過氧化氫酶（CAT）活性：CAT在一定條件下可直接分解其底H2O2，相應的吸光度降低，以每克血紅蛋白中或每毫克組織蛋白中CAT每秒分解過氧化氫的相對量為一個活力單位，計算 CAT活力；采用 2-硝基苯甲酸（DTNB）比色法測定谷胱甘肽過氧化酶（GSH-Px）活性：GSH-Px活力用催化GSH氧化的反應速度表示。GSH和DTNB反應在GSH-Px催化下可生成5-二硫代2-硝基苯甲酸陰離子，測定其濃度，即可算出GSH減少量。

1.3統計方法數據采用SPSS 13.0統計軟件分析，計量資料均采用均數±標準差表示，多組間比較采用檢驗，多重比較采用檢驗；相關性分析采用Spearman等級相關分析。＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1MDA含量及SOD、CAT、GSH-Px活性比較B組較A組腎組織MDA濃度顯著增高，而SOD、GSH-Px、CAT濃度顯著降低（均＜0.01）。與B組比較，C、D及E組腎組織MDA水平降低及SOD水平增加（均＜0.01）。見表1。

2.2草酸鈣結晶沉積情況大體標本上看，B組大鼠腎臟與A組相比腫脹明顯，剖面皮質及髓質之間分界不清，觸之有明顯的砂粒感；而經EGCG治療后腎臟大體形態與對照組差別不明顯。通過對腎組織切片HE染色觀察，發現結石組大鼠腎盂明顯擴張，腎臟皮質及髓質內可見結晶及結石形成，而經EGCG治療后上述病理變化明顯減輕。腎組織結晶與EGCG治療劑量呈負相關（=―0.483，＜0.01）。見表2。

表1　5組MDA含量及SOD、CAT、GSH-Px活性比較

表2　各組大鼠腎組織草酸鈣結晶等級評分

3　討論

腎結石可引起梗阻的導致腎積水以及繼發尿路感染，嚴重者可導致腎功能衰竭及尿源性膿毒血癥的發生，而腎結石成分最主要類型是草酸鈣結石。因此探求腎臟草酸鈣結石的形成的具體機制從而尋求抑制其生成或復發的方法具有重要意義。草酸鈣腎結石的病因復雜，到目前為止對其了解的程度仍十分有限，在控制草酸鈣腎結石的罹患率和復發率方面，仍未達到令人滿意的效果。

乙二醇法是近年較常用的制造草酸鈣腎結石大鼠模型方法，以作為草酸的前體物質，乙二醇在進入體內后，可在羥乙酸氧化酶的作用下生成乙醛酸，后者可進一步轉化為草酸，此時動物尿中草酸濃度增加。正常情況下腎小管尿液中新生的草酸鈣結晶很快被尿流沖走，無法停留聚集形成結石。在結石形成過程中草酸鈣結晶滯留在腎小管內是必要的前提條件［2］。高濃度尿草酸能使腎小管上皮產生大量的自由基，而組織中的抗氧化酶水平和活性顯著降低。為這種氧自由基增加引起的脂質過氧化，是細胞損傷的直接原因［3］。由于氧自由基與生物膜系統的不飽和脂肪酸具有高度親和性，兩者結合后使膜的不飽和脂肪酸與蛋白質比例失調，膜的液態性、流動性及通透性均隨之發生變化，最終造成膜的功能障礙。腎小管上皮細胞膜受損，使草酸鈣結晶能黏附于腎小管內壁，進而形成結石［4］。Grases等［5］在體外通過模擬腎臟的條件，證明自由基可引起上皮細胞損傷，產生一個有利于晶體生長的環境，而抗氧化劑可抑制草酸鈣晶體的形成。可見過氧化損傷是導致高草酸誘導的腎小管上皮細胞損傷的主要機制和結石形成的主要途徑［6］。本研究草酸鈣腎結石大鼠模型腎臟組織學檢查發現大鼠腎皮質及髓質內均有大量草酸鈣結晶形成，同時發現腎組織中丙二醛濃度升高，而抗氧化酶活性降低，說明該腎結石大鼠模型在草酸鈣結石形成過程中氧化應激扮演了重要的角色。

茶多酚是綠茶提取物中多酚類物質的總稱，具有多種較強的抗氧化生物學活性成分，如黃酮類、兒茶素、酚酸類以及花色苷類等［7］。兒茶素是黃烷醇的衍生物之一，可分為四類，茶多酚以EGCG含量最高［8］。EGCG分子量為458.4，結構式為C22H18O11，其分子結構中的三羥基結構B環與其抗氧化能力有關。綠茶多酚其活性成分主要包括表EGCG可通過其抗氧化能力對腎組織損傷起保護作用。使用EGCG處理輸尿管閉塞動物，腎組織中活性氧水平顯著下降，組織損傷明顯減輕，同時能夠明顯延緩腎功能下降的發生。在狼瘡腎炎動物中使用EGCG，其腎功能、尿蛋白以及腎組織病理損傷較腎炎小鼠顯著改善［9］。以上文獻回顧結合氧化應激在泌尿系草酸鈣結石的發生發展過程中的重要作用，推測具有抗氧化及保護腎臟作用的EGCG很可能對對草酸鈣腎結石形成具有抑制作用。

本實驗用不同劑量EGCG干預草酸鈣腎結石動物大鼠模型成石，結果大鼠腎組織中的MDA顯著低于成石組，而抗氧化酶濃度均顯著高于成石組。腎組織中的結晶沉積情況亦隨EGCG劑量增加逐漸減少，兩者呈負相關。此結果進一步說明氧化應激在泌尿系草酸鈣結石的發生發展過程中的重要作用，而EGCG可以明顯減少誘石劑誘導的大鼠腎草酸鈣結石的形成。

［1］辛文虎，明星.腎小管上皮細胞損傷與草酸鈣腎結石形成機制的研究進展［J］.國際泌尿系統雜志，2013，33（4）:539-542.

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［3］Selvam R.Calcium oxalat e stone disease: roleoflipidperoxidationandantioxidants［J］. Urol Res，2002，30:35.

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［5］Grases F，Garcia-Ferragut L，Costa-BauzaA.Developmentofcalciumoxalate crystals on urothelium effect of free radicals［J］.Nephron，1998，78（3）:296-301.

［6］厲建，李文峰，張士青.尿草酸對腎草鈣結石形成和腎組織自由基影響的研究［J］.中國實驗診斷學，2008，12（7）:853-855.

［7］孫海嵐.茶多酚的抗炎研究進展［J］.重慶醫學，2012，41（35）:3766-3768.

［8］葛建，林芳，李明揆，等.表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）生物活性研究進展［J］.安徽農業大學學報，2011，38（2）:156-163.

［9］張媛媛，侯衛平，袁發煥，等.EGCG對腎臟疾病保護作用的研究進展［J］.中國中西醫結合腎病雜志，2013，14（11）:1022-1024.

10.3969/j.issn.1671-0800.2016.04.045

R692.5

A

1671-0800（2016）04-0502-03

2015-11-10

（本文編輯：鐘美春）

寧波市自然科學基金項目（2013A610267）

315100寧波，寧波市泌尿腎病醫院

湯春波，Email：TCB73@ 163.com